جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية
Summary
ووصف طريقة بسيطة وموثوق بها عن العزلة وثقافة من الخلايا الجذعية العصبية من أنسجة الأجنة البشرية تجاهل القشرية. ويمكن استخدام الثقافات المستمدة من الاضطرابات العصبية يعرف الإنسان المرضية لتوصيف العمليات الخلوية والجزيئية ، فضلا عن توفير منبر لتقييم فعالية العقاقير.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يقيمون على طول منطقة البطين الظهارة العصبية خلال وضع لوحة القشرية. هذه الأسلاف في وقت مبكر يعطي في نهاية المطاف إلى ظهور الأسلاف والمتوسطة في وقت لاحق. مختلف أنواع فرعية الخلية العصبية والدبقية التي تشكل القشرة الدماغية القدرة على توليد وتوسيع NSCs الإنسان (ما يسمى neurospheres) من أنسجة الأجنة تجاهل العادي مع توفر وسيلة للدراسة بشكل مباشر على الجوانب الوظيفية العادية التنمية البشرية NSC 1-5. ويمكن أيضا أن يكون هذا النهج الموجه نحو جيل من NSCs من الاضطرابات العصبية المعروفة ، مما يتيح الفرصة لتحديد العمليات التي تغير انتشار المرض السلف ، والهجرة ، وتمايز 6-9. وقد ركزنا على تحديد الآليات المرضية في الإنسان NSCs متلازمة داون التي قد تساهم في مرض الزهايمر النمط الظاهري لتسريع 10،11. ولا يستطيع أحد في الجسم الحي ، ولا في نماذج الماوس المختبر تكرار ذخيرة مماثلة من الجينات الموجودة على الكروموسوم البشري 21.
هنا نستخدم طريقة بسيطة وموثوق بها لعزل متلازمة داون NSCs من القشور أجهضت الجنين البشري وزرعها في الثقافة. المنهجية توفر جوانب محددة من حصاد الأنسجة ، والتشريح مع معالم التشريحية محدودة ، والفرز الخلية ، والطلاء ، والركض من NSCs الإنسان. كما نقوم بتوفير بعض البروتوكولات الأساسية لإحداث تمايز NSCs الإنسان في خلية فرعية أكثر انتقائية.
Protocol
Discussion
هناك نهج مختلف تجاه نسيج ثقافة جديدة وانتاج خطوط الخلايا البشرية. تاريخيا ، لم تحصد أنسجة جديدة وتربيتها على الفور لتوليد مختلف أنواع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي. هذا النهج غير محدودة بشكل واضح من قبل عدد من العينات التي يمكن الحصول عليها والتي في حالة العينات ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة : HD054347 وNS063997 – 01 إلى VLS. كما أيد هذا العمل في جزء من صندوق الدولة الإمبراطورية الخلايا الجذعية من خلال إدارة ولاية نيويورك للصحة العقد # C024324 لVLS. الآراء التي أعرب عنها هنا هي فقط تلك التي للمؤلف ، ولا تعبر بالضرورة عن مجلس الدولة الإمبراطورية الخلايا الجذعية ، وولاية نيويورك وزارة الصحة ، أو ولاية نيويورك. VLS هو عالم دوريس ديوك السريرية التنموي مستلم الجائزة. كما نشكر الأستاذ تيموثي فارتانيان عن هديته المضادة للأجسام المضادة للO1 O4.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
References
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O’Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down’s syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r., Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?. Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
