Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel
Summary
Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.
Abstract
Neurale stamcellen (NSCs) verblijven langs de ventriculaire zone neuroepithelium tijdens de ontwikkeling van de corticale plaat. Deze vroege voorouders uiteindelijk aanleiding geven tot intermediaire voorouders en later de verschillende neuronale en gliale cel subtypes dat de cerebrale cortex formulier. De capaciteit te genereren en uit te breiden menselijke NSCs (de zogenaamde neurospheres) uit afgedankte normaal foetaal weefsel een middel waarmee direct de studie van de functionele aspecten van de normale menselijke ontwikkeling van NSC 1-5. Deze aanpak kan ook worden gericht op het genereren van NSCs van bekende neurologische aandoeningen, waardoor bieden de mogelijkheid om ziekte processen die stamvader proliferatie, migratie en differentiatie 6-9 te veranderen te identificeren. Hebben we ons gericht op het identificeren van pathologische mechanismen in de menselijke het syndroom van Down NSCs die kunnen bijdragen aan de ziekte van Alzheimer versnelde fenotype 10,11. Zowel in vivo als in vitro de muis modellen kunnen repliceren de identieke repertoire van genen op menselijk chromosoom 21.
Hier gebruiken we een eenvoudige en betrouwbare methode om te isoleren het syndroom van Down NSCs van geaborteerde foetussen menselijke cortex en ze groeien in de cultuur. De methode biedt specifieke aspecten van het oogsten van de weefsel, dissectie met een beperkte anatomische oriëntatiepunten, cell sorting, beplating en de passage van de menselijke NSC. We bieden ook een aantal fundamentele protocollen voor het induceren van differentiatie van humane NSCs naar meer selectieve cel subtypes.
Protocol
Discussion
Er zijn verschillende benaderingen in de richting van cultuur verse weefsel en de productie van menselijke cellijnen. Historisch gezien is fris weefsel geoogst en onmiddellijk gekweekt om verschillende celtypes in het centrale zenuwstelsel te genereren. Deze benadering wordt echter duidelijk beperkt door het aantal monsters dat kan worden verkregen, die in het geval voor de menselijke monsters, is het meestal vrij klein. Gezien de minimale mate van manipulatie, vers gekweekte neurale cellen zorgen voor de meest betrouwb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health: HD054347 en NS063997-01 naar VLS. Dit werk werd ook ondersteund gedeeltelijk door de Empire State Stem Cell Fonds via de New York State Department of Health Contract # C024324 naar VLS. De meningen hier zijn uitsluitend die van de auteur en geven niet noodzakelijk overeen met die van de Empire State Stem Cell van Commissarissen, de New York State Department of Health, of de staat van New York. VLS is een Doris Duke Clinical Scientist Award Developmental Ontvanger. We danken ook professor Timothy Vartanian voor zijn gave van het Anti-O1, Anti-O4 antilichamen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
References
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O’Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down’s syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r., Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?. Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
