הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית
Summary
שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.
Abstract
בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים יחד neuroepithelium אזור חדרית במהלך הפיתוח של הצלחת קליפת המוח. אלה אבות מוקדם בסופו של דבר להצמיח אבות ביניים מאוחר יותר, תת שונים תא עצב גליה היוצרות את קליפת המוח. היכולת ליצור ולהרחיב NSCs האנושי (מה שנקרא neurospheres) מרקמות מושלך העובר נורמלי מספק אמצעי שבעזרתו ישירות במחקר היבטים פונקציונליים של אדם נורמלי NSC פיתוח 1-5. גישה זו יכולה גם להיות מכוונת כלפי דור NSCs מהפרעות נוירולוגיות ידוע, ובכך והנותן את ההזדמנות כדי לזהות תהליכים המשנים התפשטות מחלת אבי, הגירה בידול 6-9. התמקדנו בזיהוי מנגנוני פתולוגיים האדם NSCs תסמונת דאון שעשוי לתרום פנוטיפ המחלה אלצהיימר מואצת 10,11. גם in vivo ולא במודלים חוץ גופית העכבר יכול לשכפל את הרפרטואר זהה של גנים בכרומוזום האנושי 21.
כאן אנו משתמשים בשיטה פשוטה ואמינה כדי לבודד תסמונת דאון NSCs מ בוטלה קליפת המוח העוברי האנושי לגדל אותם בתרבית. מתודולוגיה מספקת להיבטים ספציפיים של קצירת לנתיחה, רקמה עם ציוני דרך אנטומיים מוגבל, מיון התא, ציפוי passaging NSCs של האדם. אנו מספקים גם כמה פרוטוקולים בסיסיים גרימת הבחנה של NSCs האדם לתוך תת תא בררניים יותר.
Protocol
Discussion
ישנן גישות שונות כלפי רקמות תרבות טריים לייצר שורות תאים אנושיים. מבחינה היסטורית, רקמה טרי כבר קוצרים ותרבותיים מיד לייצר תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית. אולם גישה זו היא מוגבלת בבירור במספר דגימות שניתן להשיג, אשר במקרה של דגימות האדם, הוא בדרך כלל קטן למד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: HD054347 ו NS063997-01 ל VLS. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן לתאי גזע אמפייר סטייט דרך מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות חוזה # C024324 כדי VLS בחלקו. הדעות הביעו כאן הם אך ורק של המחבר ואינן משקפות בהכרח את עמדת מועצת לתאי גזע האמפייר סטייט, מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות, או את מדינת ניו יורק. VLS היא דוריס דיוק קלינית התפתחותית המדען חתן פרס. אנחנו גם להודות לפרופסור טימותי Vartanian עבור מתנתו של Anti-O1, Anti-O4 נוגדנים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
References
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O’Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down’s syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r., Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?. Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
