Summary
Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).
Abstract
Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro informatique (μCT).
Haute résolution μCT est très polyvalent et précises (1-2 microns de résolution) pour l'examen technique de 3D de l'ex-vivo des échantillons biologiques 1, 2. Par opposition à la tomographie électronique, les μCT permet l'examen d'un maximum de 4 cm d'épaisseur des échantillons. Cette technique nécessite seulement quelques heures de la mesure par rapport aux semaines en histologie. En outre, μCT ne repose pas sur des modèles 2D stereologic, il peut donc compléter et, dans certains cas peut même remplacer les méthodes histologiques 3, 4, qui sont à la fois du temps et destructrice. Exemple de climatisation et de positionnement dans μCT est simple et ne nécessite pas de vide élevé ou basse température, ce qui peut nuire à la structure. L'échantillon est positionné et une rotation de 180 ° ou 360 ° entre un microfocused source de rayons X et un détecteur, qui comprend un scintillateur et une caméra CCD précise, pour chaque angle d'une image 2D est prise, puis l'ensemble du volume est reconstruit en utilisant un des différents algorithmes disponibles 5-7. La résolution en 3D augmente avec la diminution de l'étape de rotation. Le protocole vidéo actuelle montre les principales étapes de la préparation, l'immobilisation et le positionnement de l'échantillon suivi par imagerie à haute résolution.
Protocol
1. La préparation des échantillons
- Après l'extraction du tissu qui doit être examiné, tissus minéralisés peuvent être positionnés dans l'instrument et imagé. Pour l'image du fémur une souris doit suivre les étapes suivantes:
- Retirez la jambe après mortem d'un embryon C57/BL6 18,5 postceutus jours (E18.5).
- Joint le bout étroit d'une pipette en polystyrène (20-200 ul) à l'aide de résine époxy ou d'une autre colle, et remplissez la pointe avec le tampon de travail (PBS ou autre).
- Monter solidement la jambe dans la pointe et sceller l'autre extrémité avec une feuille de parafilm.
- Placez la pointe de la pipette dans un support approprié et suivre le protocole à partir du chapitre 3. Pour visualiser le fémur de la jambe de l'embryon de souris, l'instrument est mis en 40 KV et 200 uA. Pour 8μ résolution 1000 images de projection avec un grossissement de 4x doivent être acquises.
- Non minéralisées des tissus doivent être initialement fixées et colorées afin d'augmenter l'atténuation des rayons X sur le tissu d'intérêt en utilisant un des nombreux protocoles disponibles 8,9. Pour les poumons de rats et des échantillons similaires, le protocole de préparation est la suivante:
- L'implantation de non Orthotopical le carcinome pulmonaire à petites cellules (CBNPC) NCI-H460 sur les poumons de rats nus
- Nodules de cancer du poumon commence à être détectable 4 semaines à partir d'implantation
- Sacrifice le rat et immédiatement infuser avec une solution saline mélangée avec de l'héparine
- Y injecter une solution diluée d'Microfil (Flowtech), (2 ml de solution de composé, 3 ml de diluant et 0,3 ml de durcisseur) dans le ventricule gauche à tacher la circulation bronchique
- Extraire les poumons et le cœur du rat
- Immobiliser l'échantillon (voir chapitre 2 du protocole) en montage serré dans un tube à essai en plastique de 50 ml
- Créer une atmosphère d'éthanol saturé par la mise sur le fond du tube un chiffon imbibé d'éthanol
- Collez ou visser le tube dans un support de l'instrument
- Procéder à l'établissement des paramètres d'imagerie (chapitre 3). Pour l'imagerie complète des poumons de rats de la source est fixé à 40KV et 100 uA. Afin d'atteindre la résolution 16μ on a à acquérir 2500 images de projection à un grossissement de 0.5x.
2. Exemple immobilisation
En haute résolution, il est important d'éviter tout changement dans la position de l'échantillon pendant la mesure. Pour cela, l'échantillon est solidement fixé dans un récipient en plastique qui s'adapte à sa taille. Embouts de pipette en polystyrène, plastique ou pipettes Pasteur spécialement construit supports en plastique sont utilisés à cet égard. Selon les exigences expérimentales, l'échantillon peut être examiné dans l'air ou immergés dans des solutions d'éthanol ou de tampon. Immobilisation typique et le positionnement final de la jambe de l'embryon de souris dans l'instrument est montré dans la figure 1.
Figure 1. Positionnement final de la jambe embryonnaires de souris dans l'instrument de micro CT.
3. Réglage des paramètres d'acquisition: x-ray tension et de courant, le temps d'exposition du CCD
- Placé dans un support, l'échantillon est mis dans la phase de rotation de l'instrument
- Une première image aux rayons X est pris avec la tension et de courant fixé arbitrairement.
- Si l'image est trop sombre, on devrait augmenter le nombre de photons d'abord, ainsi augmenter un peu le courant. Si cela ne suffit pas, on devrait augmenter légèrement l'énergie des photons de rayons X, c'est à dire la tension sur le tube à rayons X.
- Si l'image est trop claire, il faut d'abord diminuer la tension, le courant.
- La luminosité de l'image peut être augmentée en binning. Binning de 1 prend en compte l'intensité de chaque pixel de l'image, tandis que binning de 2 prend la somme de chaque matrice de 2x2 pixels. L'image sera environ 4 fois plus brillante que dans le cas de binning 1, mais il aura la moitié de la résolution.
- Après avoir réglé la luminosité optimale, il faut optimiser le temps d'exposition de la caméra à un compromis entre le meilleur contraste sur un côté et une durée raisonnable de l'expérience d'un autre côté.
- Le contraste des images, notamment des échantillons de faible absorption, peut être améliorée en utilisant des filtres, ce qui réduit le flux de photons, principalement celle des photons d'énergie inférieure.
4. Positionnement de l'échantillon
- Choisissez le grossissement de travail. Les choix possibles sont 0.5x, 4x, 10x, 20x et 40x. Le champ de vision diminue avec l'augmentation de grossissement.
- Obtenir la résolution optimale et le champ de vue en définissant la distance entre la source de rayons X et l'échantillon et entre l'échantillon et le détecteur. L'augmentation de la source à distance de l'échantillon diminue le champ de vision et augmente la résolution. Echantillon à distance du détecteur a l'effet inverse.
L'ensemble du champ pour être visualisés en 3D devrait être présent dans leimage de la projection à tous les angles. On devrait le vérifier en rotation de l'échantillon à différents angles et en amenant l'échantillon le plus près possible de l'axe de rotation. Pour cela, il faut suivre les étapes suivantes:
- Prenez une image à 0 degrés, puis faites pivoter l'échantillon à -20 degrés. Si le volume désiré est déplacée latéralement, on doit corriger sa position en repositionnant l'axe de rotation.
- Après correction, l'échantillon doit être tourné sous un autre angle et la position corrigée à nouveau, jusqu'à ce que le champ d'intérêt est à l'intérieur de l'image à tous les angles de -90 à 90 degrés.
5. Tomogramme haute résolution
- Pendant la mesure, l'échantillon est en rotation par un petit angle à la fois et à chaque angle de projection d'une image est prise. Le nombre total d'images est toujours un compromis entre la résolution souhaitée d'un côté et le temps de la mesure et la taille du fichier sur un autre côté. Comme le montre la figure 2, chaque projection unique comprend toutes les tranches de l'échantillon superposées l'une sur l'autre, et ne peut donc révéler la structure 3D de l'échantillon.
Figure 2. Projection d'images du poumon de rat à 0 ° (A), 45 ° (B) et 90 ° angle de rotation (C).
- C'est seulement après la prise d'images de projection au moins entre -90 et 90 degrés, on peut procéder à la reconstruction du volume de l'échantillon. Reconstruction prend entre 10 minutes et 2 heures, en fonction du logiciel utilisé et du nombre de projections. Encore une fois, la qualité finale de l'image 3D est un compromis entre la résolution souhaitée et le temps on veut dépenser et de la taille du fichier résultant.
6. Calibration échelle de l'image
Le niveau du pixel (valeur) dans une image reconstruite est unique pour cette image. Afin de comparer les deux images différentes, une échelle d'intensité unique doit être imposée sur chaque image. Pour cette
- Exécuter une tomographie avec une norme fantôme utilisant les mêmes conditions expérimentales que pour l'échantillon
- Recalibrer l'image de l'échantillon en utilisant les valeurs obtenues pour le fantôme. L'échelle la plus courante est le Hounsfield (ou CT) échelle. Pour un grossissement de 4x la valeur de fond de 15 000 (pour l'eau ou du PBS) a été remplacé par 0 et la valeur maximale de 35 000 pour l'os a été remplacé par la valeur standard Hounsfield de 3000. Autres valeurs de pixels résultant de l'interpolation ou extrapolation linéaire en fonction de ces limites.
7. De traitement et analyse d'images
Après l'obtention d'images haute résolution, on doit extraire les informations pertinentes en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Le logiciel d'être utilisé doit être conçu pour fonctionner avec de très gros fichiers (jusqu'à 20Go).
8. Les résultats représentatifs
Une représentation d'un fémur d'une souris C57/BL6 au jour embryonnaire 18,5 (E18.5) - quatre jours après l'initiation du processus de minéralisation est représenté en figure 3. Les couches minérales sont clairement visibles (blanc), tandis que les tissus mous ne sont pas visibles dans cette préparation. Nous avons pris 1000 images de projection avec un grossissement linéaire de 4x. La résolution finale est de 8 microns. Une analyse minutieuse du rendu de volume illustré dans la Fig.1, montre que la fraction du volume osseux (la fraction du volume osseux qui est occupé par des tissus minéralisés) est de 0,18, et la densité minérale osseuse est de 723 mg / cm 3. Ces valeurs nous permettent de comparer cette structure avec des os dans les autres stades de développement.
Figure 3. Différentes représentations d'une image 3D d'un embryon de souris du fémur. L'(coupe transversale) transversale (A), le sagittal (médio-latérale) section (B) et un aperçu du rendu de volume (C) sont représentés.
La figure 4 montre une image 3D des poumons d'un rat nu féminin (RNE), âgés de 12 semaines, implanté orthotopique avec des non un carcinome pulmonaire à petites cellules (CBNPC) NCI-H460. 2500 images de projection ont été prises avec un grossissement linéaire de 0.5x, assurant une résolution finale de 16 microns. L'image montre les vaisseaux sanguins colorés Microfil (jusqu'à 20 microns de diamètre). L'analyse des images montre que 4 semaines après l'implantation, le cancer des nodules multiples sont formées. Ils couvrent une fraction importante du volume pulmonaire (17%). La plupart des taches pulmonaires a été trouvé dans les zones périphériques des tumeurs. De manière significative, comme le montre le figure 4B, les vaisseaux sanguins de plusieurs sont présents aussi à l'intérieur des nodules, couvrant, selon l'analyse préliminaire des 3% de leur volume.
Figure 4. Image 3D de nodules de cancer de plus en plus un ratpoumon. Un instantané de la prestation de volume (A) et une section à travers le volume (B) sont présentés. Les nodules de cancer sont marqués par des flèches.
Film 1. Rendu de volume du fémur de la souris dans la figure 1. Cliquez ici pour regarder le film.
Movie 2. Rendu de volume des poumons de rats dans la figure 2. Cliquez ici pour regarder le film.
Movie 3. Sections de série à travers les poumons. Les nodules apparaissent comme des zones grises dans la plupart des tranches. Cliquez ici pour regarder le film.
Discussion
C57/BL6 souris au jour embryonnaire 18,5 (E18.5) est quatre jours après l'initiation du processus de minéralisation. A ce stade du développement, de l'os avenir est fait de plusieurs couches de osteoids minéralisée, clairement visible dans la figure 3. À ce stade, il convient de souligner que les tissus minéralisés peuvent être visualisées à faible résolution avec des instruments différents qui exigent de moins d'échantillons. Le présent protocole (et l'instrument de micro-CT utilisé dans celle-ci) en plus de fournir une résolution plus élevée, offre la meilleure flexibilité pour l'utilisateur de choisir les meilleurs paramètres géométriques de la mesure.
Résultats de la figure 4 montrent que dans les modèles animaux de cancer des poumons orthotopique, non humaine du cancer du poumon à petites cellules peuvent induire le recrutement des vaisseaux sanguins et la néovascularisation. Nous considérons que le tissu pulmonaire n'a été ni déplacé, ni sa forme modifiée lors de la mesure. L'utilisateur doit prendre des précautions particulières pour éviter de tels changements au cours d'une tomographie. Pour certains échantillons, surtout pour les plus doux de tissu, il faut construire des dispositifs spéciaux de détention qui immobilisent parfaitement l'échantillon pendant la mesure. Malheureusement, la présence de fuites élevées de l'agent de contraste dans les environs de la tumeur empêche une quantification fiable des vaisseaux sanguins périphériques. En conséquence, les images sont entachées par un agent de coloration en particulier sur les bords, ce qui est clairement présente dans les films 2 et 3. Nous ne pouvions pas éviter ce déversement, mais les informations utiles sur les nodules de cancer, y compris leur taille, la forme et la présence de vaisseaux sanguins internes n'a pas été affectée. On pourrait bien conclure qu'au moins pour la circulation bronchique qui a été étudié ici, l'approvisionnement en sang périphérique participe à la perfusion tumorale, avec quelques perfusion présents aussi à l'intérieur de la tumeur.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les études ont été menées à l'Irving Moskowitz et Cherna Center for Nano et Nano-Bio imagerie à l'Institut Weizmann des Sciences.
Nous sommes reconnaissants à Orna Yeger pour son aide dans la conception et l'exécution de ce protocole.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
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