Summary

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Abstract

Homöostatische Wartung von epithelialen Geweben erfordert die kontinuierliche Beseitigung von geschädigten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Unsere Studien haben herausgefunden, dass sterbende Zellen Signale zu senden, um ihre Nachbarn zu leben, um Form und Vertrag einen Ring aus Aktin und Myosin, dass es wirft aus der epithelialen Blatt beim Schließen etwaiger Lücken aus seiner Ausfahrt hätten ergeben können, bezeichnet ein Verfahren, Zell-Extrusion 1. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis. Zur Visualisierung Extrusion, injizieren wir ein rot fluoreszierendes Protein markierte Sonde für F-Aktin in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch-Embryos, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis und induziert Apoptose durch Zugabe von G418 zu Larven. Wir verwenden dann Zeitraffer-Imaging auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop zu Aktindynamik und Epithelzellen Verhalten während des Prozesses der apoptotischen Extrusion beobachten. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Extrusion in Live-Epithelien zu untersuchen und eine Allee zu Erkrankungen durch das Versäumnis, apoptotische Zellen zu eliminieren verursacht Studie liefern.

Protocol

Grundlegende Workflow für die Visualisierung von Aktindynamik während der Zellteilung Extrusion in der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch Die Epidermis der Entwicklung Zebrafisch besteht aus zwei verschiedenen Schichten, die Oberflächenschicht (oder Periderm) und einer basalen Schicht aus Zellen, die die Basalmembran 2 Kontakt besteht. Die Zellen der äußeren Oberflächenschicht Apoptose und werden aus dem Gewebe durch Extrusion 3 (Abbildung 1) …

Discussion

Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine einfache und unkomplizierte Methode, um den Prozess der Extrusion in einer Live-Epithelgewebe zu visualisieren. Diese Art von Experiment ermöglicht es uns, Feinheiten der Aktin-Dynamik nicht zuvor in fixiertem Gewebe Analysen geschätzt zu untersuchen, und daher ergänzt gemeinsamen Immunfluoreszenz-Methoden. Wir können dieses Protokoll in Kombination mit chemischen Inhibitoren oder genetische Mutanten eine bessere Analyse der Extrusion und Studium Erkrankungen mit dem Scheit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mitglieder der Rosenblatt Labor für wissenschaftliche Diskussionen, Anregungen und Kommentare. Wir möchten auch Mary Halloran, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert RFP-UtrCH und David Grunwald, der CK versorgt haben: GFP transgener Zebrafische. Danke auch an Gretchen König und die Mitarbeiter der Zentrale Zebrafisch Ressourcen an der Universität von Utah für exzellente Wartung und Pflege der Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom New Innovator NIH-NIGMS NIH Director des Award 1 DP2 OD002056-01 bis JR unterstützt. GTE wurde durch die NIH Multidisziplinäre Cancer Schulungsprogramm zu gewähren 5T32 CA03247-8 unterstützt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RNeasy Mini Kit Reagent Qiagen 74104  
mMessage mMachine SP6 Kit Reagent Ambion AM1340  
Crossing Tanks Tool Thoren Aquatic Systems    
The Pipet Pump Tool Bel Art Products F3789  
5 ¾ Pasteur Pipet Tool VWR 14672-608  
Microinjection Mold Tool Adaptive Science Tools I-34  
100x15mm Culture Plate Tool Fisher 08-757-12  
Flamming/Brown Micropipet Puller Tool Sutter Instrument Company Model P97  
Borosilicate Glass Capillaries with Filament Tool Sutter Instrument Company B1400-78-10 OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length
Electrode Storage Jar Tool World Precision Instruments E210  
Phenol Red Reagent Sigma P0290 0.5% in DPBS
Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator Tool Harvard Apparatus PLI-100  
35x10mm Culture Dish Tool Cellstar 627-160  
G418 (Geneticin) Reagent GIBCO 10131-035 50 mg/mL in dH20
Dumont #5 Forceps Tool Fine Science Tools 11253-20  
12cm Pin Holder Tool Fine Science Tools 26016-12  
Insert Pins Tool Fine Science Tools 26007-02 and-03  
Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass Tool MatTek P35G-1.5-10-C  
Low Melt Agarose Reagent Fisher BP1360-100  
Tricaine Reagent Sigma A-5040  
Dissecting Microscope Microscope Leica MZ6  
Dissecting Microscope Microscope Nikon SMZ645  
Fluorescent Dissecting Microscope Microscope Olympus S2X12  
Spinning Disc Confocal Microscope Microscope Nikon Eclipse Ti Outfitted with a Yokagawa spinning disc head
CCD Camera Camera Andor DV-885-VP 1002x1004x8 micron square pixels

References

  1. Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
  2. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
  3. Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
  4. Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
  5. Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
  6. Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
  7. Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  8. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  10. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).

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Cite This Article
Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689, doi:10.3791/2689 (2011).

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