Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch
Summary
Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.
Abstract
Homöostatische Wartung von epithelialen Geweben erfordert die kontinuierliche Beseitigung von geschädigten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Unsere Studien haben herausgefunden, dass sterbende Zellen Signale zu senden, um ihre Nachbarn zu leben, um Form und Vertrag einen Ring aus Aktin und Myosin, dass es wirft aus der epithelialen Blatt beim Schließen etwaiger Lücken aus seiner Ausfahrt hätten ergeben können, bezeichnet ein Verfahren, Zell-Extrusion 1. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis. Zur Visualisierung Extrusion, injizieren wir ein rot fluoreszierendes Protein markierte Sonde für F-Aktin in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch-Embryos, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis und induziert Apoptose durch Zugabe von G418 zu Larven. Wir verwenden dann Zeitraffer-Imaging auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop zu Aktindynamik und Epithelzellen Verhalten während des Prozesses der apoptotischen Extrusion beobachten. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Extrusion in Live-Epithelien zu untersuchen und eine Allee zu Erkrankungen durch das Versäumnis, apoptotische Zellen zu eliminieren verursacht Studie liefern.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine einfache und unkomplizierte Methode, um den Prozess der Extrusion in einer Live-Epithelgewebe zu visualisieren. Diese Art von Experiment ermöglicht es uns, Feinheiten der Aktin-Dynamik nicht zuvor in fixiertem Gewebe Analysen geschätzt zu untersuchen, und daher ergänzt gemeinsamen Immunfluoreszenz-Methoden. Wir können dieses Protokoll in Kombination mit chemischen Inhibitoren oder genetische Mutanten eine bessere Analyse der Extrusion und Studium Erkrankungen mit dem Scheit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Rosenblatt Labor für wissenschaftliche Diskussionen, Anregungen und Kommentare. Wir möchten auch Mary Halloran, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert RFP-UtrCH und David Grunwald, der CK versorgt haben: GFP transgener Zebrafische. Danke auch an Gretchen König und die Mitarbeiter der Zentrale Zebrafisch Ressourcen an der Universität von Utah für exzellente Wartung und Pflege der Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom New Innovator NIH-NIGMS NIH Director des Award 1 DP2 OD002056-01 bis JR unterstützt. GTE wurde durch die NIH Multidisziplinäre Cancer Schulungsprogramm zu gewähren 5T32 CA03247-8 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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