Summary

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Abstract

Epitel dokuların Homeostatik bakım bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı hücreleri sürekli çıkarılmasını gerektirir. Çalışmalarımız, ölmekte olan hücrelerin kendi çıkışına neden olabilir herhangi bir boşluk kapanış ise epitel yaprak dışarı çıkar, aktin ve miyozin bir halka oluşturacak ve sözleşme canlı komşuları sinyalleri göndermek bulduk, bir süreç olarak adlandırılan hücre ekstrüzyon 1. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada larva zebrafish epidermiste neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemi açıklanmaktadır. Ekstrüzyon görselleştirmek için, epidermisin yeşil floresan protein tek hücreli aşamasında ifade transgenik zebrafish embriyolar F-aktin kırmızı floresan proteini etiketli prob enjekte ve larvaları için G418 ek apopitoz indükleyen. Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon sürecinde aktin dinamikleri ve epitelyal hücre davranışlarını gözlemlemek için dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı görüntüleme kullanın. Bu yaklaşım bize canlı epitel ekstrüzyon işleminin araştırmak için izin verir ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak için başarısızlık neden olduğu hastalık durumlarını incelemek için bir yol sağlayacak.

Protocol

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği Görselleştirme için temel iş akışı Gelişmekte olan zebrafish epidermisin iki farklı katmanları, yüzey tabakası (veya periderm) ve bazal membran 2 kontak hücrelerinin bazal tabaka oluşur. Dış yüzey tabakasının hücrelerde apoptozis geçmesi ve ekstrüzyon 3 (Şekil 1) doku ortadan kalkar. Bu sürecin gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için, …

Discussion

Burada açıklanan protokol canlı bir epitel doku ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem gösteriyor. Bu tür deney bize sabit doku analizleri önceden takdir aktin dinamiklerinin inceliklerini incelemek için izin verir ve bu nedenle, ortak immunofluorescent yöntemleri tamamlar. Biz, inflamatuar yanıtlar ya da hasar gören hücrelerin birikimine yol açacaktır beklediğimiz apoptotik hücreleri, uzaklaştırmak ve temizlemek için yetmezliği ile ilişkili ekstrüzyon süreci ve ç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bilimsel tartışma, öneri ve görüşleriniz için Rosenblatt laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. GFP transgenik zebrafish: Biz de nazik CK plazmid kodlama RFP-UtrCH ve David Grunwald veren Mary Halloran teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Gretchen Kral ve Zebra balığı mükemmel bir bakım ve özen Utah Üniversitesi'nde Merkezi Zebra balığı Kaynak personeli. Bu çalışma, JR için OD002056-01 DP2 NIH-NIGMS NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü 1 tarafından desteklenmiştir. GTE NIH Multidisipliner Kanser Eğitim Programı Hibe 5T32 CA03247-8 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RNeasy Mini Kit Reagent Qiagen 74104  
mMessage mMachine SP6 Kit Reagent Ambion AM1340  
Crossing Tanks Tool Thoren Aquatic Systems    
The Pipet Pump Tool Bel Art Products F3789  
5 ¾ Pasteur Pipet Tool VWR 14672-608  
Microinjection Mold Tool Adaptive Science Tools I-34  
100x15mm Culture Plate Tool Fisher 08-757-12  
Flamming/Brown Micropipet Puller Tool Sutter Instrument Company Model P97  
Borosilicate Glass Capillaries with Filament Tool Sutter Instrument Company B1400-78-10 OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length
Electrode Storage Jar Tool World Precision Instruments E210  
Phenol Red Reagent Sigma P0290 0.5% in DPBS
Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator Tool Harvard Apparatus PLI-100  
35x10mm Culture Dish Tool Cellstar 627-160  
G418 (Geneticin) Reagent GIBCO 10131-035 50 mg/mL in dH20
Dumont #5 Forceps Tool Fine Science Tools 11253-20  
12cm Pin Holder Tool Fine Science Tools 26016-12  
Insert Pins Tool Fine Science Tools 26007-02 and-03  
Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass Tool MatTek P35G-1.5-10-C  
Low Melt Agarose Reagent Fisher BP1360-100  
Tricaine Reagent Sigma A-5040  
Dissecting Microscope Microscope Leica MZ6  
Dissecting Microscope Microscope Nikon SMZ645  
Fluorescent Dissecting Microscope Microscope Olympus S2X12  
Spinning Disc Confocal Microscope Microscope Nikon Eclipse Ti Outfitted with a Yokagawa spinning disc head
CCD Camera Camera Andor DV-885-VP 1002x1004x8 micron square pixels

References

  1. Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
  2. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
  3. Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
  4. Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
  5. Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
  6. Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
  7. Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  8. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  10. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).

Play Video

Cite This Article
Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689, doi:10.3791/2689 (2011).

View Video