Summary
نحن هنا تصف طريقة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. لتنقية الخلايا النجمية ، يتم هضمها كبد الفأر
Abstract
الخلايا النجمية الكبدية والكبد وخلايا المقيمين النجوم مثل التشكل وتقع في فضاء Disse بين خلايا الكبد والبطانية الجيبية 1،2 خلايا الكبد. يتم اشتقاق الخلايا النجمية من السلائف نخاع العظم وتخزين ما يصل الى 80 ٪ من فيتامين A الجسم الكلي 1 و 2. عند التنشيط ، والخلايا النجمية تفرق في myofibroblasts لإنتاج المصفوفة خارج الخلية ، مما يسهم في تليف الكبد 3. على أساس قدرتهم على العقد ، يمكن أن الخلايا النجمية myofibroblastic ينظم نغمة الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم يرتبط المدخل 4. مؤخرا ، أظهرت لنا أن الخلايا الكبدية النجمية هي خلايا مولدة قوية ، ويمكن تقديم تنشيط خلايا NKT فضلا عن الخلايا اللمفية تي التقليدية 5.
هنا نقدم طريقة لإعداد كفاءة الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. نظرا لتوطين perisinusoidal بهم ، وعزل الخلايا الكبدية النجمية هي عملية متعددة الخطوات. لجعل الخلايا النجمية للوصول إلى العزلة من مساحة Disse ، يتم perfused كبد الفأر في الموقع مع Pronase E الهضمي الانزيمات وكولاجيناز P. التروية بعد ، يخضع للعلاج أنسجة الكبد الأنزيمية إضافية مع Pronase E و P في كولاجيناز المختبر. في وقت لاحق ، وطريقة الاستفادة من كمية هائلة من قطرات الدهون فيتامين A - تخزينها في الخلايا الكبدية النجمية. هذه الميزة تسمح للانفصال عن غيرها من الخلايا النجمية أنواع الخلايا الكبدية بواسطة الطرد المركزي على التدرج Nycodenz 8 ٪. بروتوكول الموصوفة هنا تعطي السكان نقية جدا ومتجانسة من الخلايا النجمية. ويمكن تقييم نقاء استعدادات لتلوين هذا البروتين علامة الدبقية جزيء ييفي الحمضية (GFAP) ، قبل التحليل المجهري مضان أو التدفق الخلوي. مزيد من الضوء ويكشف المجهر مظهر فريد من النجوم على شكل خلايا الكبدية النجمية التي تؤوي على كميات عالية من الدهون قطرات.
أخذت معا ، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة كفاءة الخلايا الكبدية النجمية ، بما في ذلك الصور ممثل مظهرهم المورفولوجية والتعبير GFAP التي تساعد على تحديد الجهة الخلايا النجمية.
Protocol
وينبغي أن تستخدم C57BL / 6 أسابيع في الفئران 20 ~ من العمر أو المسنين. فمن المستحسن استخدام الفئران الذكور وزنها 25 - 30G. ويمكن زيادة الغلة من الخلايا النجمية عن طريق تغذية الفئران فيتامين A - المخصب الوجبة الغذائية لمدة 2 أشهر قبل نجمي العزلة الخلية. يمكن تنقية حوالي 2x10 5 خلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر C57BL / 6 واحد ، في حين أن العائد من الخلايا النجمية من BALB / ج الفئران هي أعلى بكثير. ويتم تعديل البروتوكول التالي ل5 الفئران. وأجريت التجارب ورعاية الحيوانات وفقا للرعاية الحيوان وافق المؤسسية وبروتوكولات اللجنة الاستخدام.
1. نضح في الموقع من كبد الفأر مع الإنزيمات الهضمية
- تدفئة العازلة SC1 والحلول نضح الانزيم في حمام ماء C ° 37.
- شن مجموعة التسريب المجنح على أنبوب السيليكون من مضخة تمعجية.
- معايرة المضخة مع برنامج تلفزيوني للحصول على تدفق الصفحي من 6.5ml/min ، وهو معدل التدفق الذي سيتم استخدامه لنضح في الوضع الطبيعي للكبد. يوازن أنبوب السيليكون مع SC1 الحل.
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حل واختبار ردود الافعال عن خسارة لضمان التخدر عميقة.
- الإصلاح الماوس في موقف ضعيف على قاعدة مناسبة.
- استخدام المقص والملقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وفضح البريتوني.
- فتح بعناية الصفاق وتحريك الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيمن من الحيوانات من أجل فضح الوريد البابي.
- إدراج قنية التسريب من مجموعة إلى الوريد البابي. لهذه الخطوة ، فمن المستحسن استعمال stereomicroscope.
- بدء نضح من الكبد مع الحل SC1 30ml. فتح الوريد الأجوف السفلي مباشرة بعد بدء التدفق. يشار بيغ النجاح في الكبد عن طريق فقدان لون أنسجة الكبد.
- يروي الكبد مع 30ml Pronase حل E. على الهضم ناجحة ، سوف فصوص الكبد تضخم ، وسوف تظهر فصيصات متميزة من خلال الكبسولة.
- يروي الكبد مع 30ml كولاجيناز حل ف. فقد الكبد عند هذه النقطة يبدو شكله ونائي وغير متبلور.
- بعناية فصل الكبد من الحجاب الحاجز والأجهزة المحيطة بها وتخزينها في 70ml SC2 الحل على الجليد.
- كرر الإجراء بالنسبة للفئران إضافية.
2. في الهضم من كبد فأر المختبر
وينبغي تنفيذ جميع الخطوات الأخرى العاملة تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي هود.
- قطع الكبد إلى قطع ما يقرب من 3 2x2x2mm باستخدام مقص حاد.
- الجمع بين تعليق 70ml SC2 بما في ذلك قطع الكبد مع 50ml من محلول Pronase P - E كولاجيناز وإضافة 1ml من محلول أنا الدناز.
- هضم للكبد في 37 20min C مع التحريك درجة.
3. تنبيذ متدرج الكثافة
- تعليق تصفية خلية خلية من خلال مصافى 70μm في أنابيب فالكون 6 50ml وتضيف ما يصل الى 50ml مع SC2 العازلة. الطرد المركزي ل10min في 600G و 4 درجات مئوية.
- نضح بعناية 40ml من طاف ، ثم تضاف حل 150μl أنا الدناز لكل أنبوب وresuspend الخلايا.
- تجمع تعليق خلية في أنابيب فالكون 4 50ml وتغسل مع GBSS - B ، في الطرد المركزي ل10min 600G و 4 درجات مئوية.
- نضح بعناية أكبر قدر من طاف ممكن من دون إزعاج بيليه وإضافة 150μl أنا الدناز حل لكل أنبوب. Resuspend الكريات خلية في 10ML GBSS - B في الأنبوب.
- تجمع الخلايا في أنابيب فالكون 2 50ml وإضافة GBSS - B إلى إجمالي حجم 36ml في الأنبوب. إضافة 14ml Nycodenz حل لكل أنبوب وتخلط جيدا.
- نقل 10ML لتعليق خلية في واحدة 12ml التدرج أنبوب الطرد المركزي ، مما أدى في 10 أنابيب في المجموع. تراكب بلطف مع التعليق الخلية في أنبوب 1.5ml GBSS - B.
- أجهزة الطرد المركزي ل15min التدرجات في 1500g و 4 درجات مئوية دون فرامل. في وقت لاحق ، وسوف تكون مكعبات الكبد في الجزء السفلي من الأنبوب في حين تم العثور على الخلايا النجمية في الطور البيني باعتباره حلقة بيضاء.
- الحصاد بعناية الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا النجمية ، ويغسل لهم GBSS - B ؛ ل10min الطرد المركزي في 600G و 4 درجات مئوية.
- نضح في وطاف resuspend الخلايا في DMEM 20ml تستكمل مع الحرارة المعطل FBS 10 ٪ ، 1 ٪ HEPES البنسلين / الستربتوميسين ، L - 2mm والجلوتامين ، البيروفات 1MM الصوديوم ، و10MM. نقل الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة مع تركيز 2x10 4 خلية / سم 2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- تغيير وسائل الإعلام في أقرب وقت الخلايا الكبدية النجمية هي ملتصقة (حوالي 2H بعد الإعداد) ليغسل خلايا ميتة والحطام الخلية.
- في اليوم التالي ، الخلية النجميةوينبغي ليالي تطوير قدراتها المميزة على شكل نجمة التشكل مع حويصلات فيتامين A - محيط بالنواة الدهون تخزينها.
- لتجارب لاحقة ، يمكن بسهولة الخلايا الكبدية النجمية يمكن فصل من السطوح البلاستيكية غير المغلفة باستخدام حلول الأنزيمية خفيفة مثل Accutase ، على سبيل المثال
4. ممثل النتائج :
بعد إعداد الخلايا الكبدية النجمية باستخدام بروتوكول المقدمة ، ويمكن اختبار نقاء السكان المعزولين النظر في ثلاث خصائص رئيسية من هذا نوع من الخلايا ، مثل النجوم التي تشبه شكل ، قطرات الدهون محيط بالنواة ، والتعبير عن بروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP ). وصفت الصور ممثل لظهور سمات نجمي الخلايا الكبدية 2H بعد عزل الخلايا ، وكذلك في يوم 1 و 3 من الثقافة في المختبر في الشكل 1. الشكل 2 يبين تلطيخ ممثل المناعي للخلايا النجمية GFAP في الكبد ، والتي تم تربيتها لمدة 3 أيام بعد عزل الخلية. الخلايا النجمية في الخلايا الكبدية التفريق myofibroblastic في المختبر خلال الثقافة. ومن السمات المميزة لهذه الخاصية تنشيط الخلايا النجمية هو تعبير عن العضلات ألفا أكتين السلس (αSMA). الشكل 3 يبين تلطيخ المناعي للأسماء وIIA الميوسين في تنشيط الخلايا النجمية في يوم 7 من الثقافة في المختبر.
الشكل 1. التشكل المميزة من الخلايا النجمية الكبدية. تم عزل الخلايا النجمية من كبد فأر باستخدام بروتوكول المقدمة. وتصور هذه المشاهد الخلايا النجمية 2H بعد عزل الخلية (أ ، ب) ، وكذلك في يوم 1 (ج) ويوم 3 (د) من الثقافة في المختبر. الخلايا النجمية الكبدية يحمل كميات كبيرة من الدهون في مواقع حويصلات محيط بالنواة واكتساب المتميزة مثل نجمي التشكل خلال الأيام الأولى من المختبر في الثقافة (التكبير 200X).
الشكل 2. الخلايا النجمية الكبدية أعرب GFAP تحديدا في الكبد. وكانت الخلايا النجمية معزولة والملون لimmunofluorescently GFAP (الحمراء) في يوم 3 من الثقافة في المختبر. وصفت نواة خلية في الزرقاء (هويشت صمة عار).
الشكل 3. خلايا الكبد النجمية تفرق في myofibroblasts. ومثقف الخلايا النجمية الكبدية المعزولة من الفئران C57BL / 6 لمدة 7 أيام. في وقت لاحق ، تم نقلهم إلى غرفة الشرائح والملون لأسماء (كما هو موضح باللون الأحمر) والميوسين IIA (كما هو مبين باللون الأخضر). وكانت نواة الخلية counterstained مع هويشت (الأزرق).
| SC1 العازلة | |
| EGTA | 190mg |
| جلوكوز | 900mg |
| HEPES | 10 مل من محلول المخزون 1M |
| بوكل | 400mg |
| غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| كلوريد الصوديوم | 8G |
| ناه 2 ص 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| الفينول الأحمر | 6mg |
| DH 2 O | ملء تصل إلى 1L |
| SC2 العازلة | |
| CaCl 2 × 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10ML من محلول المخزون 1M |
| بوكل | 400mg |
| غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| كلوريد الصوديوم | 8G |
| ناه 2 ص 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| الفينول الأحمر | 6mg |
| DH 2 O | ملء تصل إلى 1L |
| GBSS - A العازلة | |
| بوكل | 370mg |
| CaCl 2 × 2H 2 O | 225mg |
| جلوكوز | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 × 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 × 7 H 2 O | 70mg |
| غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| الفينول الأحمر | 6mg |
| DH 2 O | ملء تصل إلى 1L |
| GBSS - B العازلة | |
| CaCl 2 × 2H 2 O | 225mg |
| جلوكوز | 991mg |
| بوكل | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 × 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 × 7 H 2 O | 70mg |
| غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O | 75mg |
| كلوريد الصوديوم | 8G |
| NaHCO 3 | 227mg |
| الفينول الأحمر | 6mg |
| DH 2 O | ملء تصل إلى 1L |
| Pronase الحل E الإرواء | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU / دقيقة ملغ) |
| SC2 العازلة | 200ml |
| كولاجيناز الحل ف الإرواء | |
| ف كولاجيناز | 85mg (1.78 U / ليو ملغ) |
| SC2 العازلة | 200ml |
| Pronase الحل P - E كولاجيناز | |
| Pronase E | 50mg (4000 PU / دقيقة ملغ) |
| ف كولاجيناز | 85mg (1.78 U / ليو ملغ) |
| SC2 العازلة | 50ml |
| الدناز أنا الحل | |
| أنا الدناز | 6mg (2000U/mg كاليفورنيا.) |
| GBSS - B | 3ml |
| Nycodenz الحل | |
| Nycodenz | 8G |
| GBSS - A | 28ml |
الجدول 1. مخازن والحلول المطلوبة لانزيم عزل الخلايا النجمية الكبدية. ينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني للجميع المخازن المؤقتة إلى 7،3-7،4. وعلاوة على ذلك ، فمن المستحسن الترشيح معقمة من جميع المخازن. فمن المهم للتكيف مع كمية الانزيم المستعملة وفقا لنشاط الأنزيمي معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا النجمية الكبدية تنظيم العمليات الأساسية الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض في الكبد. علاوة على ذلك ، تمتلك خصائص الخلايا النجمية تقديم المستضد ، جعلها عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الكبد المناعي. على الرغم من أن الخلايا الكبدية النجمية تشكل 10-15 ٪ من إجمالي عدد الخلايا في الكبد ، وعزل هذه الخلايا تشكل تحديا بسبب التعريب في الفضاء perisinusoidal من Disse.
نقدم هنا طريقة واضحة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر في الهضم من قبل الموقع واللاحقة الطرد المركزي التدرج. هذا البروتوكول يسمح عزل الخلايا النجمية نقية جدا مناسبة لالمقايسات المناعية.
يمكن السيطرة على الكيان من خلايا منعزلة النظر في ثلاث خصائص رئيسية للخلايا الكبدية النجمية ، بما في ذلك النجوم مثل الشكل ، ومحيط بالنواة حويصلات الدهون فيتامين A - تخزين ، والتعبير عن GFAP. وفقا لهذه المعايير ، والخلايا النجمية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول صفها بشكل روتيني ~ 99 ٪ نقية كما المقررة تلوين مناعي والتدفق الخلوي. الملوثات المحتملة من العزلة الخلايا النجمية هي كوبفر الخلايا والخلايا الجذعية في الكبد (DCS). لذا ، قمنا بتحليل الثقافات الخلية النجمية التي تلطيخ التدفق الخلوي للجزيئات سطح F4/80 (خلايا كوبفر) وCD11c (DCS). تبعا لذلك ، عدم وجود F4/80 + و + CD11c استبعاد الخلايا تلوث الاستعدادات خلية من خلايا كوبفر النجمية أو البلدان النامية. وبالتالي ، فإن هناك حاجة إلى مزيد من التخصيب أو طرق الفرز ، مما يجعل البروتوكول وصفها لنجمي الخلية الكبدية العزلة إجراء مناسب وسريع.
بشأن الكيان من الخلايا النجمية في الكبد ، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المختبر في الخلايا المستزرعة تصبح المنشط وتفرق في myofibroblasts التي تختلف جوهريا عن الخلايا النجمية هادئة. أثناء هذا التحول ، والخلايا الكبدية النجمية تعبير فضفاض من GFAP وupregulate αSMA ، والتي يمكن الكشف عنها بسهولة في يوم 7 من الثقافة في المختبر. لا سيما وتنشيط الخلايا النجمية في المختبر تشبه بقوة نمطها التنشيط في الجسم الحي 6. ويتجلى ذلك من خلال مشاركتها في تليف الكبد ، على سبيل المثال ، وإن كان غيرهم من السكان myofibroblast الكولاجين المنتجة للمساهمة في تطور المرض 7. على أن تبرم ، الخلايا النجمية الكبدية التي حصل عليها بروتوكول صفها تقدم نموذجا للخلايا النجمية هادئة وكذلك لتنشيط الكبد myofibroblasts اعتمادا على مرحلة التمايز بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة عائلة سميث للتميز في مجال الأبحاث الطبية الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة RO1 AI083426 - 01 (مهاجم). معتمدة باتريك Maschmeyer وفلاتش بواسطة ميلاني زمالات الدكتوراه من مؤسسة بورنغير إنغلهايم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
