Summary
Nous décrivons ici une méthode pour l'isolement de cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. Pour la purification de cellules étoilées, les foies de souris sont digérés
Abstract
Cellules étoilées du foie sont le foie-résident des cellules de morphologie en forme d'étoile et sont situés dans l'espace de Disse entre les cellules endothéliales sinusoïdales du foie et de 1,2 hépatocytes. Cellules étoilées sont dérivées à partir de précurseurs de moelle osseuse et de stocker jusqu'à 80% de la vitamine A totale du corps 1, 2. Lors de l'activation des cellules étoilées se différencier en myofibroblastes pour produire la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à 3 fibrose hépatique. Basé sur leur capacité à se contracter, les cellules étoilées myofibroblastique peut réguler le tonus vasculaire associée à l'hypertension portale 4. Récemment, nous avons démontré que les cellules étoilées du foie sont des cellules présentant l'antigène puissants et peuvent activer les cellules NKT ainsi que les lymphocytes T conventionnels 5.
Nous présentons ici une méthode pour la préparation efficace des cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. En raison de leur localisation périsinusoïdales, l'isolement de cellules étoilées du foie est un processus multi-étapes. Afin de rendre accessibles les cellules étoilées à l'isolement de l'espace de Disse, foies de souris sont perfusées in situ avec le E enzymes digestives pronase et la collagénase P. perfusion Après, le tissu hépatique est soumis à un traitement enzymatique supplémentaire avec pronase E et P dans la collagénase vitro. Par la suite, la méthode tire parti de l'énorme quantité de gouttelettes lipidiques de vitamine A-stockage dans les cellules étoilées du foie. Cette fonctionnalité permet la séparation des cellules étoilées du foie d'autres types de cellules par centrifugation sur un gradient de 8% Nycodenz. Le protocole décrit ici donne une population très pure et homogène de cellules étoilées. Pureté de la préparation peut être évaluée par coloration de la molécule marqueur protéique fibrillaire gliale acide (GFAP), avant l'analyse par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. En outre, la microscopie optique révèle l'aspect unique de la forme d'étoile cellules étoilées du foie qui abritent de grandes quantités de gouttelettes lipidiques.
Pris ensemble, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement efficace des cellules étoilées du foie, y compris des images représentatives de leur aspect morphologique et d'expression GFAP qui aident à définir l'entité de cellules étoilées.
Protocol
Souris C57BL / 6 doit être utilisé à ~ 20 semaines d'âge ou plus âgés. L'utilisation de souris mâles pesant 25-30g est recommandée. Le rendement des cellules étoilées peut être augmentée par l'alimentation des souris de la vitamine A régime enrichi pour 2 mois avant l'isolement de cellules étoilées. Environ 2x10 5 cellules étoilées du foie peut être purifié à partir du foie d'un C57BL / 6 de la souris, alors que le rendement des cellules étoilées du souris Balb / c est considérablement plus élevé. Le protocole suivant est ajusté à 5 souris. Et soins des animaux d'expérimentation ont été effectuées en conformité avec soin des animaux et des protocoles approuvés institutionnels Comité utilisation.
1. En perfusion in situ du foie de souris avec des enzymes digestives
- Chauffer le tampon SC1 et solutions pour perfusions d'enzymes dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Monter une perfusion ailée mis sur le tube de silicone d'une pompe péristaltique.
- Calibrer la pompe avec du PBS pour obtenir un écoulement laminaire de 6.5ml/min, qui est le débit qui sera utilisé pour la perfusion in situ dans le foie. Equilibrer le tube en silicone avec SC1 solution.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) de solution et de test pour la perte des réflexes pour assurer narcotisation profonde.
- Fixer la souris en position couchée sur un support adapté.
- Utilisez des ciseaux et des pinces à effectuer une incision longitudinale dans la peau de l'abdomen et d'exposer le péritoine.
- Ouvrez soigneusement le péritoine et déplacer les intestins hors de la cavité abdominale sur le côté gauche de l'animal afin d'exposer la veine porte.
- Insérer la canule de l'ensemble de perfusion dans la veine porte. Pour cette étape, l'utilisation d'un stéréomicroscope est recommandée.
- Démarrer la perfusion du foie avec la solution SC1 30ml. Ouvrez la veine cave inférieure immédiatement après l'ouverture de la circulation. Succès de rinçage du foie est indiquée par une perte de couleur du tissu hépatique.
- Perfuser le foie avec la solution E Pronase 30ml. Lors de la digestion réussie, les lobes du foie se gonflent, et les lobules apparaissent distincts à travers la capsule.
- Perfuser le foie avec une solution collagénase P 30ml. Le foie à ce point a perdu sa forme et regarde atone et amorphe.
- Soigneusement séparés du foie au diaphragme et les organes environnants et le stocker dans 70ml SC2 solution sur la glace.
- Répétez la procédure pour les souris supplémentaires.
2. Dans la digestion in vitro de foies de souris
Toutes les autres étapes de travail devrait être effectué dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.
- Couper les foies en morceaux d'environ 3 2x2x2mm l'aide de ciseaux pointus.
- Combinez la suspension de 70ml SC2 y compris les morceaux de foie avec 50 ml de pronase E-collagénase solution P et ajouter 1 ml de solution de DNase I.
- Recueil des foies pendant 20min à 37 ° C tout en remuant.
3. Centrifugation en gradient de densité
- Filtrer la suspension des cellules à travers les tamis cellulaire 70μm dans des tubes Falcon 50 ml et 6 ajouter jusqu'à 50ml avec SC2 tampon. Centrifuger pendant 10 minutes à 600g à 4 ° C.
- Aspirer délicatement 40ml de surnageant, puis ajouter 150μl de DNase I solution à chaque tube et remettre les cellules.
- Piscine des suspensions cellulaires en tubes 50ml Falcon 4 et lavez avec GBSS-B, centrifugeuse pour 10min à 600 g et 4 ° C.
- Aspirer délicatement autant que possible le surnageant sans perturber le culot et ajouter 150μl de DNase I solution à chaque tube. Resuspendre les culots cellulaires dans 10 ml GBSS-B par tube.
- Piscine des cellules dans des tubes Falcon 50 ml et ajouter 2 GBSS-B pour un volume total de 36ml par tube. Ajouter 14ml Nycodenz solution à chaque tube et bien mélanger.
- Transfert de 10ml de la suspension de cellules dans un tube de centrifugation en gradient de 12ml, résultant en 10 tubes au total. Doucement superposition de la suspension cellulaire avec 1.5ml GBSS-B par tube.
- Centrifuger les gradients pour 15min à 1500g et 4 ° C sans frein. Par la suite, les hépatocytes sera granulés au fond du tube tandis que les cellules étoilées sont trouvés dans l'interphase comme un anneau blanc.
- Soigneusement la récolte de l'interphase contenant les cellules étoilées et les laver avec GBSS-B; centrifugeuse pendant 10 minutes à 600g à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 20 ml de DMEM complété avec inactivé à la chaleur 10% de FBS, HEPES 1% de pénicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, et 10mm. Transférer les cellules dans des flacons de culture de tissu avec une concentration de 2x10 4 cellules / cm 2. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Changer les médias dès que les cellules étoilées du foie sont adhérentes (environ 2h après la préparation) pour laver les cellules mortes et les débris cellulaires.
- Le jour suivant, la cellule stellaires devraient développer leur caractéristique en forme d'étoile avec la morphologie des vésicules périnucléaires vitamine lipide A-stockage.
- Pour les expériences ultérieures, les cellules étoilées du foie peut être facilement détaché de surfaces en plastique non revêtus en utilisant des solutions douces enzymatiques tels que Accutase, par exemple
4. Les résultats représentatifs:
Suite à la préparation des cellules étoilées du foie en utilisant le protocole fourni, la pureté de la population isolée peut être testé considérer trois caractéristiques majeures de ce type cellulaire, comme ressemblant à une étoile forme, gouttelettes lipidiques périnucléaire, et l'expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP ). Images représentant pour l'aspect caractéristique des cellules étoilées hépatiques 2h après l'isolement cellulaire, ainsi que le jour 1 et 3 de la culture in vitro sont représentés dans la figure 1. La figure 2 montre une coloration représentative d'immunofluorescence pour la GFAP dans les cellules étoilées du foie, qui ont été cultivées pendant 3 jours suivant l'isolement cellulaire. Cellules étoilées du foie se différencier en cellules myofibroblastique au cours de culture in vitro. Une caractéristique caractéristique de ces cellules étoilées activées est l'expression de l'alpha actine musculaire lisse (αSMA). La figure 3 montre immunofluorescence pour la ZGSA et la myosine IIA dans les cellules étoilées activées au jour 7 de la culture in vitro.
Figure 1. Morphologie caractéristique des cellules étoilées du foie. Cellules étoilées ont été isolés à partir de foies de souris en utilisant le protocole fourni. Les images dépeignent étoilées 2h cellules après l'isolement cellulaire (a, b), ainsi que le jour 1 (c) et le jour 3 (d) de la culture in vitro. Cellules étoilées hépatiques présentent des quantités élevées de vésicules lipidiques sur les sites périnucléaire et acquièrent leur distinctifs astral, comme la morphologie pendant les premiers jours de culture in vitro (grossissement 200x).
Figure 2 cellules. Étoilées du foie expriment spécifiquement la GFAP dans le foie. Cellules étoilées ont été isolés et immunofluorescently colorées pour la GFAP (en rouge) au jour 3 de culture in vitro. Noyaux cellulaires sont représentées en bleu (Hoechst tache).
Figure 3 cellules. Étoilées du foie différencient en myofibroblastes. Cellules étoilées hépatiques isolées de souris C57BL / 6 ont été cultivés pendant 7 jours. Par la suite, ils ont été transférés aux diapositives de chambre et colorées pour Asma (en rouge) et la myosine IIA (représentée en vert). Les noyaux des cellules ont été contre avec Hoechst (bleu).
| SC1 Tampon | |
| EGTA | 190mg |
| Le glucose | 900mg |
| HEPES | 10 ml de solution stock 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Rouge de phénol | 6mg |
| dH 2 O | remplir jusqu'à 1l |
| SC2 Tampon | |
| CaCl 2 x 2 H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10ml de solution stock 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Rouge de phénol | 6mg |
| dH 2 O | remplir jusqu'à 1l |
| GBSS-A Tampon | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2 H 2 O | 225mg |
| Le glucose | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Rouge de phénol | 6mg |
| dH 2 O | remplir jusqu'à 1l |
| GBSS-tampon B | |
| CaCl 2 x 2 H 2 O | 225mg |
| Le glucose | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Rouge de phénol | 6mg |
| dH 2 O | remplir jusqu'à 1l |
| Solution pronase E perfusion | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU / mg min) |
| SC2 Tampon | 200ml |
| Solution de collagénase perfusion P | |
| Collagénase P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Tampon | 200ml |
| Pronase E-collagénase solution p | |
| Pronase E | 50mg (4000 PU / mg min) |
| Collagénase P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Tampon | 50ml |
| DNase I Solution | |
| DNase I | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Solution Nycodenz | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tableau 1. Tampons et solutions enzyme nécessaire pour l'isolement de cellules étoilées du foie. Le pH de tous les tampons doit être ajustée à 7.3 à 7.4. Par ailleurs, la filtration stérile de tous les tampons est recommandée. Il est important d'adapter la quantité d'enzyme utilisée en fonction de l'activité enzymatique donnée.
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Discussion
Cellules étoilées du foie réguler essentielles des processus physiologiques et physiopathologiques dans le foie. Par ailleurs, les cellules étoilées possèdent des propriétés présentant un antigène, les rendant une composante importante de la réponse immunitaire hépatique. Bien que les cellules étoilées hépatiques comprennent 10-15% du nombre total de cellules dans le foie, l'isolement de ces cellules est difficile en raison de leur localisation dans l'espace de Disse périsinusoïdales.
Nous présentons ici une méthode simple pour isoler les cellules étoilées du foie à partir de foies de souris par digestion in situ et de centrifugation en gradient de suite. Ce protocole permet l'isolement des cellules étoilées très pure adaptée pour les dosages immunologiques.
L'entité des cellules isolées peuvent être contrôlés considérer trois caractéristiques majeures des cellules étoilées du foie, y compris en étoile forme, périnucléaire vésicules lipidiques de vitamine A-stockage, et l'expression de la GFAP. Selon ces critères, les cellules étoilées obtenus en utilisant le protocole décrit sont systématiquement ~ pur à 99% tel qu'évalué par immunofluorescence et cytométrie de flux. Les contaminants possibles des cellules étoilées sont isolements cellules de Kupffer et les cellules dendritiques du foie (PED). Par conséquent, nous avons analysé les cultures de cellules étoilées par coloration de cytométrie en flux pour les molécules de surface F4/80 (cellules de Kupffer) et CD11c (PED). En conséquence, l'absence de F4/80 + et CD11c + cellules exclus contamination des préparations de cellules étoilées par les cellules de Kupffer ou DCS. Ainsi, aucune des méthodes supplémentaires d'enrichissement ou de tri sont nécessaires, ce qui rend le protocole décrit pour l'isolement des cellules hépatiques étoilées une procédure pratique et rapide.
Concernant l'entité de cellules étoilées du foie, il est important de garder à l'esprit que dans les cellules in vitro en culture deviennent activés et se différencient en myofibroblastes qui sont fondamentalement différents de cellules étoilées de repos. Au cours de cette métamorphose, les cellules étoilées hépatiques d'expression libre de la GFAP et de réguler positivement αSMA, qui peuvent être facilement détectées sur 7 jours de culture in vitro. Notamment, l'activation des cellules étoilées in vitro, ressemble fortement à leur modèle d'activation in vivo 6. Ceci est reflété par leur implication dans la fibrose du foie, par exemple, bien que d'autres populations myofibroblastes producteurs de collagène contribuent à 7 développement de la maladie. Pour conclure, cellules étoilées du foie obtenu par le protocole décrit fournir un modèle pour les cellules étoilées de repos ainsi que pour les myofibroblastes hépatiques activés en fonction de leur stade de différenciation.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Prix de la famille Smith pour l'excellence en recherche biomédicale et les NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer et Melanie Flach sont soutenus par des bourses de doctorat de la Fondation de Boehringer Ingelheim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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