Summary
Aqui nós descrevemos um método para o isolamento de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Para a purificação de células estreladas, fígado de camundongos são digeridos
Abstract
Células estreladas hepáticas são fígado residente células de estrelas, como morfologia e estão localizados no espaço de Disse entre fígado sinusoidal células endoteliais e hepatócitos 1,2. Células estreladas são derivados de precursores da medula óssea e armazenar até 80% do total do corpo de vitamina A 1, 2. Após a ativação, as células estreladas diferenciar em miofibroblastos para produzir matriz extracelular, contribuindo para a fibrose hepática 3. Base na sua capacidade de contratar, as células estreladas miofibroblástica pode regular o tom vascular associada à hipertensão portal 4. Recentemente, nós demonstramos que as células estreladas hepáticas são células antígeno apresentando potentes e podem ativar as células NKT, bem como convencionais linfócitos T 5.
Aqui apresentamos um método eficiente para a preparação de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Devido à sua localização perisinusoidal, o isolamento de células estreladas hepáticas é um processo multi-passo. A fim de tornar as células estreladas acessíveis ao isolamento do espaço de Disse, fígado de camundongos são perfundidos in situ com a enzimas digestivas pronase E e perfusão colagenase P. Em seguida, o tecido hepático é submetido a tratamento enzimático adicionais com pronase E e P colagenase em vitro. Posteriormente, o método tira proveito da enorme quantidade de gotículas de vitamina A de armazenamento de gordura nas células estreladas hepáticas. Este recurso permite a separação de células estreladas de outros tipos de células hepáticas por centrifugação em um gradiente Nycodenz 8%. O protocolo aqui descrito produz uma população altamente pura e homogénea de células estreladas. Pureza das preparações podem ser avaliados através da coloração para a molécula de proteína glial fibrilar ácida marcador (GFAP), antes da análise por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Além disso, microscopia de luz revela a aparência única em forma de estrela de células hepáticas estreladas que abrigam grandes quantidades de gotículas lipídicas.
Tomados em conjunto, nós apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento eficiente de células estreladas hepáticas, incluindo imagens representativas de sua aparência morfológica e expressão GFAP que ajudam a definir a entidade de células estreladas.
Protocol
Camundongos C57BL / 6 deve ser usado em ~ 20 semanas de idade ou mais. O uso de camundongos machos pesando 25-30g é recomendado. O rendimento das células estreladas pode ser aumentado pela alimentação camundongos uma vitamina Uma dieta enriquecida por 2 meses antes do isolamento de células estreladas. Cerca de 2x10 5 células estreladas hepáticas pode ser purificado a partir do fígado de um camundongo C57BL / 6, enquanto o rendimento de células estreladas de camundongos Balb / c é consideravelmente maior. O protocolo que se segue é ajustada para 5 camundongos. Cuidados com os animais e experimentação foram realizados em conformidade com o Animal Care aprovado Institucional e protocolos Comitê Use.
1. Na perfusão in situ de fígado de camundongos com enzimas digestivas
- Aquecer o tampão SC1 e soluções para perfusão enzima em banho-maria a 37 ° C.
- Montar um set de infusão com asas no tubo de silicone de uma bomba peristáltica.
- Calibrar a bomba com PBS para obter um fluxo laminar de 6.5ml/min, que é a vazão que serão utilizados para a situ na perfusão do fígado. Equilibrar o tubo de silicone com SC1 solução.
- Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e solução de teste de perda de reflexos para garantir narcotização profundo.
- Corrigir o mouse na posição supina em uma superfície apropriada.
- Use uma tesoura e uma pinça para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio.
- Abra cuidadosamente o peritônio e mover os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado esquerdo do animal a fim de expor a veia portal.
- Inserir a cânula do conjunto de perfusão na veia portal. Para esta etapa, o uso de um microscópio estereoscópico é recomendado.
- Iniciar a perfusão do fígado com solução SC1 30ml. Abra a veia cava inferior imediatamente após o início do fluxo. Rubor bem sucedida do fígado é indicada por uma perda de cor do tecido do fígado.
- Perfundir o fígado com a solução de 30ml pronase E. Após a digestão bem-sucedido, os lobos do fígado vai inchar, e os lóbulos aparecerá distintas através da cápsula.
- Perfundir o fígado com a solução de colagenase P 30ml. O fígado neste momento perdeu sua forma e aparência atônica e amorfo.
- Separe cuidadosamente o fígado a partir do diafragma e órgãos circundantes e armazená-lo em 70ml de solução SC2 no gelo.
- Repita o procedimento para ratos adicionais.
2. Digestão in vitro de fígado de camundongos
Todas as outras etapas de trabalho deve ser realizado sob condições estéreis em capela de fluxo laminar.
- Corte o fígado em pedaços de aproximadamente 2x2x2mm 3 usando uma tesoura afiada.
- Combine a suspensão de 70ml SC2 incluindo os pedaços de fígado com 50ml de solução pronase P E-colagenase e adicionar 1 ml de solução de DNase I.
- Digerir os fígados por 20min a 37 ° C, agitando.
3. Centrifugação em gradiente de densidade
- Filtrar a suspensão de células através de filtros de células 70μm em 6 tubos de 50ml Falcon e adicionar até 50ml com SC2 buffer. Centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente 40ml do sobrenadante, em seguida, adicione 150μl DNase solução que eu a cada tubo e ressuspender as células.
- Piscina das suspensões de células em 4 tubos de 50ml Falcon e lave com GBSS-B, centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente o máximo de sobrenadante quanto possível, sem perturbar o sedimento e adicionar 150μl DNase solução que eu a cada tubo. Ressuspender o pellets de células em 10ml GBSS-B por tubo.
- Piscina as células em dois tubos de 50ml Falcon e adicione GBSS-B para um volume total de 36ml por tubo. Adicionar 14ml de solução Nycodenz a cada tubo e misture bem.
- Transferência de 10ml da suspensão de células em um tubo de centrifugação 12ml gradiente, resultando em 10 tubos no total. Delicadamente sobrepor a suspensão de células com 1,5 ml GBSS-B por tubo.
- Centrifugar os gradientes de 15 min a 1500g e 4 ° C, sem freio. Posteriormente, hepatócitos será peletizada na parte inferior do tubo enquanto que as células estreladas são encontrados na interfase como um anel branco.
- Cuidadosamente a colheita interfase contendo as células estreladas e lavá-los com GBSS-B; centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM suplementado com 20ml inativado pelo calor de 10% FBS, HEPES 1% Penicilina / Estreptomicina, 2mM L-Glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 10 mM. Transferência das células em frascos de cultura de tecidos com uma concentração de 2x10 4 células / cm 2. Incubar as células a 37 ° C e 5% CO 2.
- Troque a mídia assim que as células estreladas hepáticas são aderentes (cerca de 2h após a preparação) para lavar as células mortas e restos celulares.
- No dia seguinte, a célula estreladass deve desenvolver sua morfologia em forma de estrela com característica perinuclear vesículas vitamina A-armazenar lipídios.
- Para os experimentos subseqüentes, as células estreladas hepáticas pode ser facilmente destacado das superfícies não-revestido de plástico leve usando soluções enzimáticas, tais como Accutase, por exemplo,
4. Resultados representativos:
Após a preparação de células estreladas hepáticas utilizando o protocolo fornecido, a pureza da população isolada podem ser testadas considerando três principais características deste tipo de célula, como estrelas, como a forma, gotículas lipídicas perinuclear, e expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP ). Imagens representativas para o aspecto característico de células estreladas hepáticas 2h após o isolamento de células, bem como no dia 1 e 3 de cultura in vitro são apresentadas na Figura 1. A Figura 2 mostra uma coloração representante de imunofluorescência para GFAP em células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por 3 dias após o isolamento de células. Células estreladas hepáticas diferenciar em células miofibroblástica durante a cultura in vitro. A marca característica dessas células estreladas ativadas é a expressão de alfa actina de músculo liso (αSMA). A Figura 3 mostra a coloração de imunofluorescência para ASMA e IIA miosina em células estreladas ativadas no dia 7 de cultura in vitro.
Figura 1. Morfologia característica de células estreladas hepáticas. Células estreladas foram isoladas de fígado de camundongos usando o protocolo fornecido. As imagens retratam 2h células estreladas após o isolamento da célula (a, b), bem como no dia 1 (c) e dia 3 (d) de cultivo in vitro. Células estreladas hepáticas apresentam grandes quantidades de vesículas lipídicas em locais perinuclear e adquirir sua morfologia astral distintivo como durante os primeiros dias de cultivo in vitro (Ampliação de 200x).
Figura 2. Células estreladas hepáticas especificamente expressar GFAP no fígado. Células estreladas foram isoladas e coradas para immunofluorescently GFAP (vermelho) no dia 3 de cultura in vitro. Núcleos das células são representadas em azul (Hoechst mancha).
Figura 3. Células estreladas hepáticas diferenciar em miofibroblastos. Células estreladas hepáticas isoladas de camundongos C57BL / 6 foram cultivadas por 7 dias. Posteriormente, eles foram transferidos para câmara de slides e corados para ASMA (mostrada em vermelho) e IIA miosina (representado em verde). Os núcleos das células foram contracorados com Hoechst (azul).
| SC1 buffer | |
| EGTA | 190mg |
| Glicose | 900mg |
| HEPES | 10 ml de solução 1M de ações |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Vermelho de fenol | 6mg |
| dH 2 O | preencher até 1l |
| SC2 buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10ml de solução estoque 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Vermelho de fenol | 6mg |
| dH 2 O | preencher até 1l |
| GBSS-A Tampão | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glicose | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Vermelho de fenol | 6mg |
| dH 2 O | preencher até 1l |
| GBSS-B buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glicose | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Vermelho de fenol | 6mg |
| dH 2 O | preencher até 1l |
| Pronase solução de perfusão E | |
| E pronase | 100mg (4000 PU / mg min) |
| SC2 buffer | 200ml |
| Colagenase solução de perfusão P | |
| Colagenase P | 85mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 buffer | 200ml |
| Pronase E-colagenase Solução P | |
| E pronase | 50mg (4000 PU / mg min) |
| Colagenase P | 85mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 buffer | 50ml |
| Solução DNase I | |
| DNase I | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz Solution | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tabela 1. Buffers e soluções de enzima necessária para o isolamento de células estreladas hepáticas. O pH de todos os buffers deve ser ajustado para 7,3-7,4. Além disso, a filtração estéril de todos os buffers é recomendado. É importante adaptar a quantidade de enzima utilizada de acordo com a determinada atividade enzimática.
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Discussion
Células estreladas hepáticas regular essenciais processos fisiológicos e fisiopatológicos no fígado. Além disso, as células estreladas possuem propriedades apresentadoras de antígenos, tornando-os um importante componente da resposta imune hepática. Embora as células estreladas hepáticas compreendem 10-15% do número total de células no fígado, o isolamento dessas células é um desafio devido à sua localização no espaço de Disse perisinusoidal.
Aqui apresentamos um método simples para isolar as células estreladas hepáticas do fígado de camundongos por situ na digestão e centrifugação em gradiente de subsequente. Este protocolo permite o isolamento de células estreladas de alta pureza adequado para testes imunológicos.
A entidade das células isoladas pode ser controlada considerando três principais características das células estreladas hepáticas, incluindo estrelas como a forma, a vitamina A-perinuclear vesículas armazenamento de lipídios, e expressão de GFAP. De acordo com estes critérios, as células estreladas obtidos utilizando o protocolo descrito são rotineiramente a 99% de pureza, avaliada pela coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo. Contaminantes potenciais de isolamentos de células estreladas são células de Kupffer e células hepáticas dendríticas (DCs). Por isso, analisamos as culturas de células estreladas por coloração citometria de fluxo para as moléculas da superfície F4/80 (células de Kupffer) e CD11c (DCs). Assim, a ausência de F4/80 + e CD11c + células excluídas contaminação de preparações de células estreladas pelas células de Kupffer ou DCs. Assim, não há outros métodos de enriquecimento ou de classificação são necessárias, tornando o protocolo descrito para o isolamento de células estreladas hepáticas um procedimento prático e rápido.
Relativamente à entidade de células estreladas hepáticas, é importante ter em mente que, em células cultivadas in vitro são ativados e se diferenciar em miofibroblastos, que são fundamentalmente diferentes de células estreladas quiescente. Durante essa metamorfose, expressão células estreladas hepáticas soltas de GFAP e upregulate αSMA, que pode ser facilmente detectado no dia 7 de cultura in vitro. Nomeadamente, a ativação de células estreladas in vitro se parece muito com o seu padrão de ativação in vivo 6. Isto é refletido pelo seu envolvimento na fibrose do fígado, por exemplo, ainda que outras populações produtoras de colágeno miofibroblastos contribuir para o desenvolvimento da doença 7. Para concluir, as células estreladas hepáticas obtida pelo protocolo descrito fornecer um modelo para as células estreladas de repouso, bem como para miofibroblastos fígado ativado dependendo de seu estágio de diferenciação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio família Smith de Excelência em Pesquisa Biomédica e RO1 AI083426 NIH-01 (FW). Patrick Maschmeyer e Melanie Flach são apoiados por bolsas de doutoramento da Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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