Summary
在这里，我们描述了从小鼠肝的肝星状细胞的分离方法。小鼠肝脏星状细胞的纯化，消化
Abstract
肝星状细胞是明星般形态的肝居民细胞，并在位于肝窦内皮细胞和肝细胞 1,2之间的狄氏空间。星状细胞来源于骨髓前体和存储总体内维生素A 1，2至80％ 。激活后，星状细胞分化成肌纤维母细胞产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。根据合同的能力，肌纤维母细胞星状细胞能调节血管张力与门脉高压症4相关。最近，我们表明，肝星状细胞是有效的抗原提呈细胞，并能激活NKT细胞以及传统的T淋巴细胞5。
在这里，我们提出了一种从小鼠肝的肝星状细胞的高效制备方法。由于他们的窦周本地化，肝星状细胞的分离是一个多步骤的过程。为了呈现星状细胞Disse间隙隔离， 就地消化酶链霉蛋白酶E和胶原酶体育以下灌注小鼠肝脏灌注，肝组织与链霉蛋白酶E和胶原酶P遭受额外的酶处理体外 。随后，该方法需要大量的维生素A储存在肝星状细胞的脂滴的优势。此功能允许从其他类型的肝细胞在8％Nycodenz梯度离心星状细胞的分离。这里描述的协议产生的星状细胞的高纯度和均匀的人口。纯度可评估染色标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP），荧光显微镜或流式细胞仪分析前的准备工作。此外，光镜下显示星形海港高量的脂滴的肝星状细胞的独特的外观。
两者合计，我们提出一个详细的协议为有效地隔离对肝星状细胞，包括有代表性的图像，其外观形态和GFAP的表达，有助于确定星状细胞实体。
Protocol
C57BL / 6小鼠，应使用〜20周岁或以上。雄性小鼠，体重25 - 30G的建议使用。星状细胞的产量可以增加喂养小鼠2个月前维生素A丰富的饮食，以星状细胞的分离。纯化约2X10 5肝星状细胞可以从一个C57BL / 6小鼠的肝脏，而星状细胞BALB / C小鼠的产量是相当高的。以下协议是调整至5只小鼠。按照批准的机构动物护理和使用委员会的协议进行了动物保健和实验。
1， 在小鼠肝脏原位灌注消化酶
- 温暖的SC1的缓冲液在37℃水浴和酶灌注解决方案。
- 挂载到蠕动泵硅胶管翅输液。
- 校准泵用PBS获得6.5ml/min，这是将用于肝脏原位灌注流量的层流。 SC1溶液平衡的硅胶管。
- 通过腹腔注射氯胺酮（90毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤）解决方案和测试的反射损失，以确保深narcotization麻醉鼠标。
- 鼠标固定在一个合适的基础上的仰卧姿势。
- 用剪刀和镊子执行纵形切口在腹部皮肤，暴露腹膜。
- 小心打开腹膜，腹腔移动肠子动物的左侧，以揭露门静脉。
- 插入导管进入门静脉输液。对于这一步，立体显微镜的使用建议。
- 启动30毫升SC1溶液的肝脏灌注。打开后，立即启动流腔静脉劣势。表示成功冲洗肝脏的肝组织失去色彩。
- 肝脏灌注30毫升链霉蛋白酶E解决方案。肝叶成功消化后，会膨胀，小叶会出现不同的胶囊通过。
- 肝脏灌注30毫升胶原酶P解决方案。在这一点上的肝脏已经失去了它的形状和外观失张力和无定形。
- 仔细分离隔膜和周围器官的肝脏和存储在冰70毫升SC2的解决方案。
- 额外的小鼠重复的程序。
2。在体外对小鼠肝脏的消化
所有进一步的工作步骤，应在无菌层流罩条件下进行。
- 肝脏切成约2x2x2mm 3件使用锋利的剪刀。
- 结合70毫升星际暂停包括链霉蛋白酶E -胶原酶P解决方案50毫升肝片和添加的DNA酶I溶液1毫升。
- 精华20min的肝脏在37 ° C，同时搅拌。
3。密度梯度离心
- 到650毫升猎鹰管通过70μm细胞滤网过滤细胞悬液和SC2的缓冲区添加至50ml。 600克和4 ° C离心10分钟
- 小心吸上清液40毫升，再加入150μlDNA酶我的解决方案，以每管和悬浮细胞。
- 池成450毫升猎鹰管细胞悬液和GBSS - B，离心10min后清洗600克和4 ° C。
- 小心吸互不干扰颗粒和我的解决方案，以每管加入150μlDNA酶尽可能上清。重新悬浮于10ml GBSS - B的每管细胞沉淀。
- 池细胞分化成250毫升猎鹰管和GBSS - B的添加的36毫升每管总量。 14毫升Nycodenz解决每管加入拌匀。
- 转移到一个12毫升梯度离心管的细胞悬浮液10ml，共造成10管。轻轻覆盖1.5毫升GBSS - B的每管细胞悬液。
- 15分钟的梯度离心1500克和4 ° C不带刹车。随后，肝细胞将在试管底部沉淀，而星状细胞的发现为白色环相间。
- 仔细收获相间的星状细胞，并用他们GBSS - B的离心10分钟，在600克和4 ° C。
- 吸出上清液，并辅以10％热灭活胎牛血清，1％青霉素/链霉素，2mm的L -谷氨酰胺，1MM，丙酮酸钠，和10mm HEPES20毫升的DMEM重悬细胞。 2X10 4个细胞/厘米2的浓度，转移到组织培养瓶中的细胞。在37 ° C和5％的CO 2孵育细胞。
- 更改媒体尽快肝星状细胞是贴壁（约2h后编制）洗掉死细胞和细胞碎片。
- 翌日，星状细胞s应该发展自己的星型的形态特征与核周维生素A储存的脂质囊泡。
- 随后的实验中，肝星状细胞可以很容易地脱离非涂布塑料表面使用，如Accutase，如轻度的酶解决方案
4。代表性的成果：
使用协议提供的肝星状细胞的准备，隔离种群的纯度可以考虑这种细胞类型，如明星般的造型，核周脂滴，表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP的三大特色测试， ）。代表图片的外观细胞分离后的肝星状细胞2H的特征，以及第1天， 并在体外培养3如图1所示。图2显示了一个代表，已为3天，细胞的分离培养的肝星状细胞GFAP的免疫荧光染色。肝星状细胞分化成肌纤维母细胞在体外培养过程中。这些激活的星状细胞的一个特征标志是α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的表达。图3显示了在激活的星状细胞在体外培养的第7天阿斯玛和肌球蛋白IIA的免疫染色。
图1对肝星状细胞的特性形态。鼠标使用协议提供的肝脏星状细胞分离。图像描绘星状细胞后，细胞分离2H（A，B），以及第1天（c）和（D） 在体外培养3天。肝星状细胞表现出高量的脂质囊泡在核周网站， 并在体外培养的第一天（放大200X）收购其独特的星芒状的形态。
图2肝星状细胞在肝脏中特异性表达GFAP的。星状细胞的分离和immunofluorescently（GFAP红）染色，在体外培养的第3天。细胞核是描绘在蓝色（赫斯特染色）。
图3。肝星状细胞分化成肌纤维母细胞。 C57BL / 6小鼠的肝星状细胞培养7天。随后，他们被转移到玻片和阿斯玛（显示为红色）和肌球蛋白IIA（绿色显示）染色。细胞核用Hoechst counterstained（蓝色）。
| SC1的缓冲区 | |
| EGTA | 190mg |
| 血糖 | 900mg |
| HEPES | 10毫升1M原液 |
| 氯化钾 | 400毫克 |
| NA 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| 氯化钠 | 8克 |
| 的NaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| 碳酸氢钠3 | 350毫克 |
| 酚红 | 6mg |
| DH 2 O | 填补至1L |
| SC2的缓冲区 | |
| 氯化钙2 × 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10毫升的1M原液 |
| 氯化钾 | 400毫克 |
| NA 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| 氯化钠 | 8克 |
| 的NaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| 碳酸氢钠3 | 350毫克 |
| 酚红 | 6mg |
| DH 2 O | 填补至1L |
| GBSS的一个缓冲区 | |
| 氯化钾 | 370mg |
| 氯化钙2 × 2H 2 O | 225mg |
| 血糖 | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30毫克 |
| 氯化镁2 × 6 H 2 O | 210mg |
| 硫酸镁4 × 7 H 2 O | 70mg |
| NA 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 75毫克 |
| 碳酸氢钠3 | 227mg |
| 酚红 | 6mg |
| DH 2 O | 填补至1L |
| GBSS - B的缓冲区 | |
| 氯化钙2 × 2H 2 O | 225mg |
| 血糖 | 991mg |
| 氯化钾 | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30毫克 |
| 氯化镁2 × 6 H 2 O | 210mg |
| 硫酸镁4 × 7 H 2 O | 70mg |
| NA 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 75毫克 |
| 氯化钠 | 8克 |
| 碳酸氢钠3 | 227mg |
| 酚红 | 6mg |
| DH 2 O | 填补至1L |
| 链霉蛋白酶发送灌注液 | |
| 链霉蛋白酶Ë | 100毫克（4000聚氨酯/毫克分钟） |
| SC2的缓冲区 | 200毫升 |
| 胶原酶P灌注液 | |
| 胶原酶P | 85mg（1.78 U /毫克lyo） |
| SC2的缓冲区 | 200毫升 |
| 链霉蛋白酶E -胶原酶P解决方案 | |
| 链霉蛋白酶Ë | 50毫克（4000聚氨酯/毫克分钟） |
| 胶原酶P | 85mg（1.78 U /毫克lyo） |
| SC2的缓冲区 | 50毫升 |
| DNA酶我解决方案 | |
| DNA酶我 | 6mg（约2000U/mg） |
| GBSS - B | 3毫升 |
| Nycodenz解决方案 | |
| Nycodenz | 8克 |
| GBSS - A | 28毫升 |
表1。缓冲器和肝星状细胞分离所需的酶解决方案。所有的缓冲区的pH值应调整为7.3-7.4。此外，无菌过滤所有缓冲区的建议。重要的是要适应用于根据给定的酶的活性的酶量。
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Discussion
肝星状细胞在肝脏调节必不可少的生理和病理过程。此外，星状细胞具有抗原提呈属性，使其肝免疫反应的一个重要组成部分。虽然肝星状细胞在肝细胞总数占10-15％，这些细胞的分离是具有挑战性的，因为他们在狄氏窦周空间的本地化。
在这里，我们提出了一个简单的方法来隔离 ，就地消化和后续梯度离心法从小鼠肝脏中的肝星状细胞。此协议允许适合免疫分析，高纯度的星状细胞的分离。
考虑肝星状细胞，包括明星般的形状，核膜维生素A储存的脂质囊泡和GFAP表达的三个主要特点是可以控制的实体分离的细胞。根据这些标准，使用所描述的协议获得的星状细胞免疫荧光染色和流式细胞仪评估例行〜99％的纯。星状细胞隔离潜在的污染物Kupffer细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们分析流动F4/80的表面分子（枯否细胞）的CD11c（DCS）的流式细胞仪染色的星状细胞培养。因此，F4/80的情况下和的CD11c +细胞排除Kupffer细胞或区议会的星状细胞制剂的污染。因此，没有进一步浓缩或排序方法是必需的，渲染肝星状细胞的分离一个方便，快捷的的程序所描述的协议。
关于对肝星状细胞的实体，重要的是要记住，在体外培养细胞被激活并分化成肌纤维母细胞，从根本上静态星状细胞的不同。在这个变态，肝星状细胞松散表达GFAP和上调αSMA，它可以很容易地在体外培养的第7天检测。值得注意的是，激活星状细胞在体外非常类似于它们在体内 6的激活模式。这反映了他们参与肝纤维化，例如，尽管其他的胶原蛋白的生产肌纤维母细胞的人口， 促进疾病的发展7，。最后，描述协议的肝星状细胞为静态的星状细胞激活肝肌纤维母细胞根据其分化阶段以及提供一个模式。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由史密斯一家在生物医学研究和NIH的RO1 AI083426 - 01（星期六）的卓越奖。帕特里克Maschmeyer和梅拉妮Flach支持勃林格殷格翰基金会博士奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
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