Summary
Hier beschrijven we een methode voor de isolatie van leverstellaatcellen van muis lever. Voor stellaatcellen cel zuivering, muis levers verteerd
Abstract
Stellaatcellen zijn lever-ingezeten cellen van ster-achtige morfologie en bevinden zich in de ruimte van Disse tussen lever sinusoïdale endotheelcellen en hepatocyten 1,2. Stellaatcellen zijn afgeleid van het beenmerg precursoren en opslaan van maximaal 80% van het totale lichaam vitamine A 1, 2. Bij de activering stellaatcellen differentiëren in myofibroblasten aan de extracellulaire matrix te produceren, en aldus bijdragen tot leverfibrose 3. Op basis van hun vermogen om contract, kan myofibroblastic stellaatcellen reguleren van de vasculaire tonus geassocieerd met portale hypertensie 4. Onlangs toonden we aan dat leverstellaatcellen zijn potente antigeen presenterende cellen en kan activeren NKT-cellen evenals conventionele T-lymfocyten 5.
Hier presenteren we een methode voor de efficiënte voorbereiding van leverstellaatcellen van muis lever. Door hun perisinusoïdale lokalisatie, de isolatie van leverstellaatcellen is een multi-step proces. Met het oog op stellaatcellen toegankelijk voor isolatie van de ruimte van Disse maken, muis levers worden perfusie in situ met de spijsverteringsenzymen pronase E en Collagenase P. Na perfusie, is de lever weefsel onderworpen aan een extra enzymatische behandeling met pronase E en Collagenase P in vitro. Vervolgens heeft de methode maakt gebruik van de enorme hoeveelheid vitamine A-opslag van lipide druppels in leverstellaatcellen. Deze functie kan de scheiding van stervormige cellen uit andere lever celtypen door centrifugeren op een 8% Nycodenz verloop. Het protocol hier beschreven geeft een zeer zuivere en homogene populatie van stellaatcellen. Zuiverheid van de voorbereiding kan worden beoordeeld door kleuring voor de marker molecule gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP), voorafgaand aan de analyse van fluorescentie microscopie of flowcytometrie. Verder lichtmicroscopie onthult het unieke uiterlijk van stervormige leverstellaatcellen dat grote hoeveelheden van lipide druppels haven.
Samen genomen, presenteren we een gedetailleerd protocol voor de efficiënte isolatie van leverstellaatcellen, met inbegrip van representatieve beelden van hun morfologische uiterlijk en GFAP expressie die helpen om de stellaatcel cel entiteit te definiëren.
Protocol
C57BL / 6 muizen worden gebruikt op ~ 20 weken oud of ouder. Het gebruik van de mannelijke muizen met een gewicht van 25 30g wordt aanbevolen. De opbrengst van stellaatcellen kan verhoogd worden door het voeren van muizen een vitamine A-verrijkt dieet gedurende 2 maanden voorafgaand aan celisolatie stellatum. Ongeveer 2x10 5 leverstellaatcellen kan worden gezuiverd uit de lever van een C57BL / 6 muis, terwijl de opbrengst van stervormige cellen van Balb / c muizen is aanzienlijk hoger. Het volgende protocol is aangepast aan de 5 muizen. Verzorging van dieren en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde Institutional Animal Care en gebruik Comite protocollen.
1. In situ perfusie van de muis levers met spijsverteringsenzymen
- Verwarm de SC1 buffer en enzym perfusie-oplossingen in een 37 ° C waterbad.
- Monteer een gevleugelde infusieset op de siliconen tube van een peristaltische pomp.
- Kalibreer de pomp met PBS tot een laminaire stroming van 6.5ml/min, dat is het debiet die zullen worden gebruikt voor de in situ perfusie van de lever te verkrijgen. Equilibreren de siliconen tube met SC1 oplossing.
- Verdoven van de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) oplossing en test voor het verlies van reflexen tot diepe narcotizatie te verzekeren.
- Zet de muis in rugligging op een geschikte ondergrond.
- Gebruik schaar en een tang om een longitudinale incisie in de buikhuid te voeren en het buikvlies bloot te leggen.
- Voorzichtig open het buikvlies en verplaats de ingewanden uit de buikholte naar de linkerkant van het dier om de poortader bloot te leggen.
- Plaats de canule van de infusieset in de poortader. Voor deze stap, is het gebruik van een stereomicroscoop aanbevolen.
- Start de perfusie van de lever met 30ml SC1 oplossing. Open de vena cava inferior onmiddellijk na het starten van de stroom. Succesvolle spoelen van de lever wordt aangegeven door een verlies van kleur van het leverweefsel.
- Perfuseren de lever met 30ml pronase E-oplossing. Na een succesvolle spijsvertering, zal de lever kwabben zwellen, en de melkklieren zal verschijnen onderscheiden door middel van de capsule.
- Perfuseren de lever met 30ml Collagenase P oplossing. De lever op dit punt heeft verloren zijn vorm en ziet er atonische en amorf.
- Haal voorzichtig de lever vanuit het middenrif en de omliggende organen en op te slaan in 70 ml SC2 oplossing op ijs.
- Herhaal de procedure voor de overige muizen.
2. In vitro vertering van de muis levers
Alle verdere werken stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap.
- Snijd de levers in stukjes van ongeveer 3 2x2x2mm met behulp van een scherpe schaar.
- Combineer de schorsing van 70ml SC2 inbegrip van de lever stukken met 50 ml pronase E-Collagenase P-oplossing en voeg 1 ml DNase I-oplossing.
- Digest de levers voor 20min bij 37 ° C onder roeren.
3. Dichtheidsgradiënt centrifugatie
- Filter de celsuspensie door middel van 70μm cel zeven in 6 50ml Falcon buizen en optellen tot 50 ml met SC2 buffer. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 600 g en 4 ° C.
- Zorgvuldig aspireren 40ml van het supernatans, voeg dan 150μl DNase I-oplossing aan elke buis en resuspendeer de cellen.
- Het zwembad van het celsuspensies in 4 50 ml Falcon buizen en wassen met GBSS-B, centrifuge voor 10min bij 600 g en 4 ° C.
- Zorgvuldig aspireren zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk zonder de pellet te verstoren en voeg 150μl DNase I-oplossing aan elke buis. Resuspendeer de cel pellets in 10ml GBSS-B per tube.
- Zwembad de cellen in twee 50 ml Falcon buizen en voeg GBSS-B tot een totaal volume van 36ml per tube. Voeg 14ml Nycodenz oplossing aan elke buis en meng goed.
- Overdracht 10 ml van de celsuspensie in een 12ml gradiënt centrifugatie buis, wat resulteert in 10 tubes in totaal. Voorzichtig overlay de celsuspensie met 1,5 ml GBSS-B per tube.
- Centrifugeer de gradiënten voor 15 minuten bij 1500g en 4 ° C zonder rem. Vervolgens zal hepatocyten gepelleteerd worden op de bodem van de buis terwijl stellaatcellen zijn te vinden in de interfase als een witte ring.
- Voorzichtig oogst de interfase waarin de stellaatcellen en was ze met GBSS-B, centrifuge voor 10min bij 600 g en 4 ° C.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine, 2mm L-Glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, en 10mm HEPES. Breng de cellen in weefselkweek kolven met een concentratie van 2x10 4 cellen / cm 2. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Wijzig de media zodra de leverstellaatcellen zijn aanhanger (ongeveer 2 uur na het preparaat) te wassen dode cellen en celresten.
- Op de volgende dagen, de stellaatcel cels moeten ontwikkelen hun kenmerkende vorm van een ster morfologie met perinucleaire vitamine A-opslag lipide blaasjes.
- Voor de daaropvolgende experimenten, kan leverstellaatcellen gemakkelijk worden losgemaakt van niet-gecoate kunststof oppervlakken met een milde enzymatische oplossingen, zoals Accutase, bijvoorbeeld
4. Representatieve resultaten:
Naar aanleiding van de voorbereiding van leverstellaatcellen met de meegeleverde protocol, kan de zuiverheid van de geïsoleerde bevolking worden getest overweegt drie belangrijke kenmerken van dit type cel, zoals de ster-achtige vorm, perinucleaire lipide druppels, en expressie van gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP ). Vertegenwoordiger van foto's voor het karakteristieke uiterlijk van leverstellaatcellen 2 uur na celisolatie, en op dag 1 en 3 van in vitro cultuur zijn afgebeeld in figuur 1. Figuur 2 toont een representatieve immunofluorescentiekleuring voor GFAP in leverstellaatcellen, die zijn gekweekt voor de 3 dagen na celisolatie. Leverstellaatcellen differentiëren in myofibroblastic cellen tijdens de in vitro cultuur. Een kenmerk kenmerk van deze geactiveerde stellaatcellen is de expressie van alfa gladde spieren actine (αSMA). Figuur 3 toont immunofluorescentiekleuring voor ASMA en myosine IIA in geactiveerde stellaatcellen op dag 7 van de in vitro cultuur.
Figuur 1. Kenmerkend voor de morfologie van leverstellaatcellen. Stellaatcellen werden geïsoleerd uit muizen levers met de bijgeleverde protocol. De beelden tonen stellaatcellen 2 uur na celisolatie (a, b), en op dag 1 (c) en dag 3 (d) van de in vitro cultuur. Leverstellaatcellen vertonen grote hoeveelheden van lipide vesicles op perinucleaire plaatsen en het verwerven van hun onderscheidende astraal-achtige morfologie tijdens de eerste dag van de in vitro cultuur (vergroting 200x).
Figuur 2. Leverstellaatcellen specifiek etnisch uitdrukken in de lever. Stellaatcellen werden geïsoleerd en immunofluorescently gekleurd voor GFAP (rood) op dag 3 van in vitro cultuur. Celkernen zijn afgebeeld in blauw (Hoechst vlek).
Figuur 3. Lever stellaatcellen differentiëren tot myofibroblasten. Leverstellaatcellen geïsoleerd van C57BL / 6 muizen werden gekweekt voor 7 dagen. Vervolgens werden ze overgebracht naar kamer dia's en gekleurd voor ASMA (in rood) en myosine IIA (afgebeeld in groen). De celkernen werden tegengekleurd met Hoechst (blauw).
| SC1 Buffer | |
| EGTA | 190mg |
| Glucose | 900 mg |
| HEPES | 10 ml van 1 M stockoplossing |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Phenol Red | 6mg |
| dH 2 O | te vullen tot 1l |
| SC2 Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 ml 1M-stamoplossing |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Phenol Red | 6mg |
| dH 2 O | te vullen tot 1l |
| GBSS-A Buffer | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucose | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Phenol Red | 6mg |
| dH 2 O | te vullen tot 1l |
| GBSS-B Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucose | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Phenol Red | 6mg |
| dH 2 O | te vullen tot 1l |
| Pronase E perfusieoplossing | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU / mg min) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Collagenase P perfusieoplossing | |
| Collagenase P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Pronase E-Collagenase P Solution | |
| Pronase E | 50 mg (4000 PU / mg min) |
| Collagenase P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 50ml |
| DNase I Solution | |
| DNase I | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3 ml |
| Nycodenz Solution | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28 ml |
Tabel 1. Buffers en enzym-oplossingen die nodig zijn voor de isolatie van leverstellaatcellen. De pH van alle buffers moet worden aangepast om 7,3-7,4. Verder wordt steriele filtratie van alle buffers aan te bevelen. Het is belangrijk aan te passen de hoeveelheid enzym gebruikt in overeenstemming met de gegeven enzymatische activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverstellaatcellen reguleren essentiële fysiologische en pathofysiologische processen in de lever. Bovendien stellaatcellen bezitten antigeen presenterende eigenschappen, waardoor ze een belangrijk onderdeel van de lever immuunrespons. Hoewel leverstellaatcellen bestaan uit 10-15% van het totale aantal cellen in de lever, is isolatie van deze cellen uitdagend als gevolg van hun lokalisatie in de ruimte van Disse perisinusoïdale.
Hier presenteren we een eenvoudige methode om leverstellaatcellen van muis levers te isoleren door in situ spijsvertering en de daaropvolgende gradiënt centrifugatie. Dit protocol maakt de isolatie van zeer zuivere stellaatcellen die geschikt zijn voor immunologische assays.
De entiteit van de geïsoleerde cellen kan worden gecontroleerd overweegt drie belangrijke kenmerken van leverstellaatcellen, waaronder ster-achtige vorm, perinucleaire vitamine A-opslag van lipide vesicles, en expressie van GFAP. Volgens deze criteria, stellaatcellen verkregen met behulp van de beschreven protocol worden routinematig ~ 99% zuiver zoals vastgesteld door immunofluorescentie kleuring en flowcytometrie. Potentiële contaminanten van stellaatcellen cel isolaties zijn Kupffer cellen en de lever dendritische cellen (DC's). Daarom hebben we stellaatcellen celculturen geanalyseerd door middel van flowcytometrie kleuring van het oppervlak moleculen F4/80 (Kupffer cellen) en CD11c (DC's). Dienovereenkomstig, de afwezigheid van F4/80 + en CD11c + cellen uitgesloten besmetting van stellaatcellen celbereidingen door Kupffercellen of DCS. Zo worden er geen verdere verrijking of sorteren methoden die nodig zijn, waardoor de beschreven protocol voor stellaatcellen celisolatie een handige en snelle procedure.
Met betrekking tot de entiteit van leverstellaatcellen, is het belangrijk om in gedachten te houden dat in vitro gekweekte cellen worden geactiveerd en in myofibroblasten die fundamenteel verschillen van latente stellaatcellen differentiëren. Tijdens deze metamorfose, leverstellaatcellen losse uitdrukking van GFAP en upregulate αSMA, die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd op dag 7 van de in vitro cultuur. Met name de activering van stellaatcellen in vitro lijkt sterk op hun activatie patroon in vivo 6. Dit komt tot uiting door hun betrokkenheid bij leverfibrose, bijvoorbeeld, zij het andere collageen producerende myofibroblast bevolking bij te dragen tot ziekte-ontwikkeling 7. Tot slot, leverstellaatcellen verkregen door het beschreven protocol een model voor latente stellaatcellen alsmede voor geactiveerde myofibroblasten lever, afhankelijk van hun differentiatie podium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de familie Smith Award for Excellence in biomedisch onderzoek en NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer en Melanie Flach worden ondersteund door PhD beurzen van de Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
