Summary
यहाँ हम माउस जिगर से यकृत तारामय कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन. तारामय सेल शुद्धि के लिए, माउस यकृत को पचा रहे हैं
Protocol
C57BL 6 / चूहों ~ उम्र के 20 सप्ताह या पुराने पर किया जाना चाहिए. पुरुष 25-30g वजन चूहों के इस्तेमाल की सिफारिश की है. तारामय कोशिकाओं की उपज चूहों को 2 महीने के लिए एक विटामिन एक समृद्ध आहार खिलाने से पहले सेल अलगाव तारामय की वृद्धि हुई किया जा सकता है है है. 2x10 लगभग 5 यकृत तारामय कोशिकाओं को एक माउस / 6 C57BL के जिगर से शुद्ध किया जा सकता है, जबकि Balb / ग चूहों से तारामय कोशिकाओं की उपज काफी अधिक है . निम्नलिखित प्रोटोकॉल 5 चूहों को निकाला जाता है. पशु देखभाल और प्रयोग अनुमोदित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
1. माउस यकृत के स्वस्थानी छिड़काव में पाचन एंजाइमों के साथ
- गर्म और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में SC1 बफर एंजाइम छिड़काव समाधान.
- एक पंखों वाला एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के सिलिकॉन ट्यूब पर सेट जलसेक माउंट.
- पीबीएस के साथ पंप जांचना 6.5ml/min, जो प्रवाह की दर है कि जिगर की स्वस्थानी छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा है की एक लामिना का प्रवाह प्राप्त करने के लिए. SC1 समाधान के साथ सिलिकॉन ट्यूब संतुलित करना.
- Ketamine (90 मिलीग्राम / किग्रा) और (10 मिग्रा / किग्रा) समाधान और सजगता के नुकसान के लिए गहरी नींद लानेवाली औषधि से होनेवाली बेहोशी सुनिश्चित के लिए परीक्षण Xylazine intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize.
- एक उपयुक्त आधार पर लापरवाह स्थिति में माउस को ठीक करें.
- पेट की त्वचा में एक अनुदैर्ध्य चीरा प्रदर्शन और पेरिटोनियम बेनकाब कैंची और संदंश का प्रयोग करें.
- ध्यान पेरिटोनियम खुला और आंतों से बाहर ले जाने के उदर गुहा के क्रम में पोर्टल शिरा बेनकाब जानवर के बाईं ओर.
- पोर्टल नस में सेट लगाने की प्रवेशनी डालें. इस कदम के लिए, एक stereomicroscope के इस्तेमाल की सिफारिश की है.
- 30ml SC1 समाधान के साथ जिगर के छिड़काव शुरू करो. प्रवाह की शुरुआत के तुरंत बाद रग Cava अवर खोलें. जिगर के सफल निस्तब्धता जिगर ऊतक के रंग का एक नुकसान से संकेत दिया है.
- 30ml Pronase ई समाधान के साथ जिगर Perfuse. सफल पाचन पर, जिगर lobes प्रफुल्लित, और lobules कैप्सूल के माध्यम से अलग दिखाई देगा.
- 30ml Collagenase पी समाधान के साथ जिगर Perfuse. इस बिंदु पर जिगर इसके आकार खो दिया है और निर्बल और अनाकार लग रहा है.
- डायाफ्राम और आसपास के अंगों से ध्यान जिगर अलग और यह बर्फ पर 70ml SC2 समाधान में संग्रहीत.
- अतिरिक्त चूहों के लिए प्रक्रिया दोहराएँ.
2. माउस यकृत की इन विट्रो पाचन में
सभी आगे काम कर कदम एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत बाहर किया जाना चाहिए.
- तेज कैंची का उपयोग 2x2x2mm लगभग 3 के टुकड़े में यकृत कट .
- SC2 70ml के निलंबन सहित 50ml Pronase ई Collagenase पी समाधान के साथ जिगर के टुकड़े का मिश्रण है और DNase मैं समाधान के 1ml जोड़ने.
- 37 में 20min के लिए यकृत डाइजेस्ट ° सी, जबकि क्रियाशीलता.
3. घनत्व ढाल centrifugation
- 70μm सेल strainers के माध्यम से 6 50ml फाल्कन ट्यूबों में सेल निलंबन और फ़िल्टर 50ml SC2 बफर के साथ जोड़ने. 600g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10min के लिए अपकेंद्रित्र
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के 40ml aspirate, तो प्रत्येक ट्यूब 150μl DNase मैं समाधान जोड़ने और resuspend कोशिकाओं.
- 4 50ml फाल्कन ट्यूबों में सेल निलंबन पूल और 10min के लिए GBSS बी, अपकेंद्रित्र के साथ 600g और 4 पर धो डिग्री सेल्सियस
- ध्यान से गोली और जोड़ने के 150μl DNase मैं प्रत्येक ट्यूब के समाधान के बिना परेशान के रूप में संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के में ज्यादा aspirate. ट्यूब प्रति GBSS बी 10ml में सेल छर्रों Resuspend.
- पूल 2 50ml फाल्कन ट्यूबों में कोशिकाओं और ट्यूब प्रति 36ml की कुल मात्रा GBSS बी जोड़ने. प्रत्येक ट्यूब 14ml Nycodenz समाधान जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- एक 12ml ढाल centrifugation ट्यूब में स्थानांतरण सेल निलंबन के 10ml, कुल में 10 ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप. धीरे 1.5ml GBSS बी ट्यूब प्रति के साथ सेल निलंबन उपरिशायी.
- 1500g और 4 में 15min के लिए gradients के अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस ब्रेक के बिना. बाद में, ट्यूब के नीचे hepatocytes pelleted हो जबकि तारामय कोशिकाओं को एक सफेद अंगूठी के रूप interphase में पाए जाते हैं.
- ध्यान interphase तारामय कोशिकाओं से युक्त फसल और GBSS - बी के साथ उन्हें धोने, 10min के लिए 600g और 4 पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 20ml DMEM में 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल Glutamine 2mm 1mm सोडियम पाइरूवेट, और 10mm HEPES के साथ पूरक कोशिकाओं resuspend. टिशू कल्चर बोतल में 2x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक एकाग्रता के साथ कोशिकाओं का स्थानांतरण . 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 कोशिकाओं को सेते हैं .
- मीडिया के रूप में जल्द ही के रूप में यकृत तारामय कोशिकाओं (लगभग 2 तैयारी के बाद) अनुयायी के लिए रवाना हो मृत कोशिकाओं और सेल मलबे धो रहे हैं बदलें.
- अगले दिन, तारामय सेल परएस perinuclear विटामिन ए भंडारण लिपिड vesicles के साथ उनकी विशेषता आकारिकी स्टार के आकार का विकास करना चाहिए.
- बाद के प्रयोगों के लिए, यकृत तारामय कोशिकाओं को आसानी गैर लेपित प्लास्टिक Accutase, जैसे जैसे हल्के एंजाइमी समाधान का उपयोग कर सतहों से अलग किया जा सकता है
4. प्रतिनिधि परिणाम:
यकृत तारामय प्रदान प्रोटोकॉल का उपयोग कर कक्षों की तैयारी के बाद, पृथक जनसंख्या की पवित्रता इस सेल प्रकार के तीन प्रमुख ऐसे स्टार की तरह आकार, perinuclear लिपिड बूंदों, और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFAP के रूप में, विशेषताओं पर विचार परीक्षण किया जा सकता है ). सेल अलगाव के बाद यकृत तारामय कोशिकाओं 2 की विशेषता उपस्थिति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो संस्कृति में 1 और दिन 3 पर के लिए प्रतिनिधि चित्रों को चित्र 1 में दर्शाया गया है. चित्रा 2 यकृत तारामय कोशिकाओं है, जो सेल अलगाव के बाद तीन दिनों के लिए किया गया सुसंस्कृत है में GFAP के लिए एक प्रतिनिधि immunofluorescence धुंधला हो जाना दिखाता है. यकृत तारामय कोशिकाओं के दौरान myofibroblastic कोशिकाओं में इन विट्रो संस्कृति में अंतर. उन सक्रिय तारामय कोशिकाओं की एक विशेषता बानगी अल्फा चिकनी पेशी actin (αSMA) की अभिव्यक्ति है. चित्रा 3 Asma और मायोसिन आईआईए के लिए इन विट्रो संस्कृति में 7 दिन पर सक्रिय तारामय कोशिकाओं में immunofluorescence धुंधला हो जाना दिखाता है.
चित्रा 1 यकृत तारामय कोशिकाओं की विशेषता आकारिकी. तारामय कोशिकाओं माउस प्रदान प्रोटोकॉल का उपयोग कर यकृत से अलग थे. छवियों तारामय कोशिकाओं सेल अलगाव के बाद 2 (a, b), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1 दिन (ग) और इन विट्रो संस्कृति में दिन 3 (घ) पर चित्रित. यकृत तारामय कोशिकाओं perinuclear स्थलों पर प्रदर्शन लिपिड vesicles की उच्च मात्रा और इन विट्रो संस्कृति में के पहले दिन (200x आवर्धन) के दौरान उनके विशिष्ट सूक्ष्म तरह आकारिकी हासिल है.
चित्रा 2 यकृत तारामय कोशिकाओं विशेष रूप से जिगर में GFAP व्यक्त करते हैं. तारामय कोशिकाओं अलग थे और इन विट्रो संस्कृति में 3 दिन immunofluorescently GFAP (लाल) के लिए दाग . सेल नाभिक नीले (दाग Hoechst) में चित्रित कर रहे हैं.
Figure 3. लिवर तारामय कोशिकाओं myofibroblasts में अंतर है . यकृत तारामय चूहों से C57BL 6 / अलग कोशिकाओं 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे. बाद में, वे कक्ष स्लाइड्स को हस्तांतरित कर रहे थे और Asma (लाल रंग में दिखाया गया है) और मायोसिन (आईआईए हरे रंग में चित्रित) के लिए दाग. सेल नाभिक Hoechst (नीला) के साथ counterstained थे.
| SC1 बफर | |
| EGTA | 190mg |
| ग्लूकोज़ | 900mg |
| HEPES | 1M शेयर समाधान के 10 मिलीलीटर |
| KCl | 400mg |
| ना 2 HPO 4 एक्स 2 एच 2 हे | 151mg |
| NaCl | 8g |
| नाह 2 4 एक्स एच 2 हे पीओ | 78mg |
| 3 NaHCO | 350mg |
| Phenol लाल | 6mg |
| DH 2 हे | 1l करने के लिए भरने |
| SC2 बफर | |
| CaCl 2 x 2H 2 हे | 560mg |
| HEPES | 1M शेयर समाधान के 10ml |
| KCl | 400mg |
| ना 2 HPO 4 एक्स 2 एच 2 हे | 151mg |
| NaCl | 8g |
| नाह 2 4 एक्स एच 2 हे पीओ | 78mg |
| 3 NaHCO | 350mg |
| Phenol लाल | 6mg |
| DH 2 हे | 1l करने के लिए भरने |
| GBSS - एक बफर | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 हे | 225mg |
| ग्लूकोज़ | 991mg |
| 2 के.एच. पीओ 4 | 30mg |
| MgCl 2 एक्स 6 एच 2 हे | 210mg |
| MgSO 4 x 7 एच 2 हे | 70mg |
| ना 2 HPO 4 एक्स 2 एच 2 हे | 75mg |
| 3 NaHCO | 227mg |
| Phenol लाल | 6mg |
| DH 2 हे | 1l करने के लिए भरने |
| GBSS - बी बफर | |
| CaCl 2 x 2H 2 हे | 225mg |
| ग्लूकोज़ | 991mg |
| KCl | 370mg |
| 2 के.एच. पीओ 4 | 30mg |
| MgCl 2 एक्स 6 एच 2 हे | 210mg |
| MgSO 4 x 7 एच 2 हे | 70mg |
| ना 2 HPO 4 एक्स 2 एच 2 हे | 75mg |
| NaCl | 8g |
| 3 NaHCO | 227mg |
| Phenol लाल | 6mg |
| DH 2 हे | 1l करने के लिए भरने |
| Pronase ई परफ्यूज़न समाधान | |
| Pronase ई | 100mg (चार हज़ार पु / मिलीग्राम मिनट) |
| SC2 बफर | 200ml |
| Collagenase पी परफ्यूज़न समाधान | |
| Collagenase पी | 85mg (1.78 यू / मिलीग्राम lyo) |
| SC2 बफर | 200ml |
| Pronase ई Collagenase पी समाधान | |
| Pronase ई | 50mg (पु +४००० / मिलीग्राम मिनट) |
| Collagenase पी | 85mg (1.78 यू / मिलीग्राम lyo) |
| SC2 बफर | 50ml |
| DNase मैं समाधान | |
| DNase मैं | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS - बी | 3ml |
| Nycodenz समाधान | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS - | 28ml |
तालिका 1. Buffers और एंजाइम यकृत तारामय कोशिकाओं के अलगाव के लिए आवश्यक समाधान. सभी buffers की पीएच 7.3-7.4 करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, सभी buffers की बाँझ निस्पंदन की सिफारिश की है. यह महत्वपूर्ण है के लिए दिया enzymatic गतिविधि के अनुसार किया एंजाइम की राशि के अनुकूल है.
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Discussion
यकृत तारामय कोशिकाओं को जिगर में आवश्यक शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं को विनियमित. इसके अलावा, तारामय कोशिकाओं प्रतिजन पेश गुणों के अधिकारी, उन्हें यकृत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक प्रतिपादन. हालांकि यकृत तारामय कोशिकाओं को जिगर में कुल सेल नंबर के 10-15% शामिल है, इन कोशिकाओं के अलगाव Disse के perisinusoidal अंतरिक्ष में अपने स्थानीयकरण की वजह से चुनौती दे रहा है.
यहाँ हम एक सरल विधि द्वारा स्वस्थानी पाचन और बाद में ढाल centrifugation में माउस यकृत से यकृत तारामय कोशिकाओं को अलग प्रस्तुत करते हैं . यह प्रोटोकॉल उच्च शुद्ध तारामय immunologic assays के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के अलगाव परमिट.
अलग कक्षों की इकाई स्टार की तरह आकार, perinuclear विटामिन ए भंडारण लिपिड vesicles, और GFAP की अभिव्यक्ति सहित यकृत तारामय कोशिकाओं के तीन प्रमुख विशेषताओं पर विचार नियंत्रित किया जा सकता है. इन मानदंडों के अनुसार, तारामय वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्राप्त कोशिकाओं नियमित ~ 99% शुद्ध immunofluorescent धुंधला हो जाना और प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन के रूप में कर रहे हैं. तारामय सेल isolations के संभावित contaminants Kupffer कोशिकाओं और जिगर वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) हैं. इसलिए, हम सतह F4/80 अणुओं (Kupffer कोशिकाओं) और CD11c (DCs) के लिए प्रवाह cytometry धुंधला द्वारा तारामय सेल संस्कृतियों का विश्लेषण किया. तदनुसार, F4/80 के अभाव + और CD11c + कोशिकाओं तारामय सेल की तैयारी की Kupffer कोशिकाओं या DCs द्वारा संदूषण को बाहर. इस प्रकार, आगे कोई संवर्धन या छँटाई तरीकों के लिए आवश्यक हैं, यकृत तारामय सेल अलगाव एक सुविधाजनक और तेजी से प्रक्रिया के लिए में वर्णित प्रोटोकॉल प्रतिपादन.
यकृत तारामय कोशिकाओं की संस्था के संबंध में, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि इन विट्रो सभ्य कोशिकाओं में सक्रिय हो जाते हैं और myofibroblasts है कि मौलिक मौन तारामय कोशिकाओं से अलग हैं में अंतर है. इस कायापलट के दौरान, यकृत तारामय कोशिकाओं GFAP के ढीले अभिव्यक्ति और upregulate αSMA, जो इन विट्रो संस्कृति में 7 दिन पर आसानी से पता लगाया जा सकता है. विशेष रूप से, इन विट्रो में तारामय कोशिकाओं के सक्रियण दृढ़ता से 6 vivo में अपने सक्रियण पैटर्न जैसा दिखता है . यह जिगर तंतुमयता, जैसे अपने अन्य कोलेजन उत्पादन myofibroblast आबादी रोग 7 विकास के लिए योगदान, यद्यपि शामिल करके परिलक्षित होता है. निष्कर्ष निकालना, यकृत तारामय वर्णित प्रोटोकॉल से प्राप्त कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सक्रिय जिगर उनके भेदभाव मंच पर निर्भर करता है myofibroblasts लिए मौन तारामय कोशिकाओं के लिए एक मॉडल उपलब्ध कराने.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम बायोमेडिकल अनुसंधान और NIH AI083426 01-RO1 (परिवार कल्याण) में उत्कृष्टता के लिए स्मिथ परिवार पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था. पैट्रिक Maschmeyer और मेलनी Flach Boehringer Ingelheim फाउंडेशन से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
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- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
