Summary
Aquí se describe un método para el aislamiento de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Para la purificación de células estrelladas, hígados de los ratones se digieren
Abstract
Las células estrelladas hepáticas son residentes del hígado de las células de la estrella-como la morfología y se encuentran en el espacio de Disse entre el hígado y las células endoteliales sinusoidales 1,2 hepatocitos. Las células estrelladas se derivan de los precursores de la médula ósea y almacenar hasta 80% de la vitamina A del cuerpo total de 1, 2. Tras la activación, las células estrelladas se diferencian en miofibroblastos para producir la matriz extracelular, contribuyendo así a la fibrosis del hígado 3. Con base en su capacidad para contratar, las células estrelladas miofibroblástico puede regular el tono vascular asociado a la hipertensión portal 4. Recientemente, hemos demostrado que las células estrelladas hepáticas son potentes células presentadoras de antígeno y puede activar las células NKT, así como los linfocitos T convencionales 5.
Aquí presentamos un método para la preparación eficaz de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Debido a su localización perisinusoidal, el aislamiento de las células estrelladas hepáticas es un proceso de múltiples pasos. A fin de que las células estrelladas accesible para el aislamiento del espacio de Disse, hígados de los ratones son perfundidos in situ con el Pronasa digestivo E enzimas colagenasa y la perfusión P. Después, el tejido hepático se somete a tratamiento enzimático adicional con pronasa E y P en la colagenasa vitro. Posteriormente, el método se aprovecha de la enorme cantidad de gotas de vitamina A de lípidos que almacena en las células estrelladas hepáticas. Esta característica permite la separación de las células estrelladas hepáticas de otros tipos de células por centrifugación en un 8% de pendiente Nycodenz. El protocolo descrito aquí produce una población muy pura y homogénea de las células estrelladas. Pureza de las preparaciones pueden ser evaluados mediante la tinción de la molécula de proteína glial fibrilar marcador ácida (GFAP), previo al análisis por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Además, la microscopía de luz revela el aspecto único de la forma de estrella, las células estrelladas hepáticas que albergan grandes cantidades de gotitas de lípidos.
En conjunto, se presenta un protocolo detallado para el aislamiento eficiente de las células estrelladas hepáticas, incluyendo imágenes representativas de su aspecto morfológico y la expresión de GFAP que ayudan a definir la entidad de células estrelladas.
Protocol
Ratones C57BL / 6 se debe utilizar en aproximadamente 20 semanas de edad o más. El uso de ratones macho de 25 a 30 g se recomienda. El rendimiento de las células estrelladas se puede aumentar por la alimentación de los ratones de la vitamina A dieta enriquecida por 2 meses antes de que el aislamiento de células estrelladas. Aproximadamente 2x10 5 células estrelladas hepáticas pueden purificar a partir del hígado de un C57BL / 6 del ratón, mientras que el rendimiento de las células estrelladas de ratones Balb / c es mucho mayor. El siguiente protocolo se ajusta a 5 ratones. Cuidado de los animales y la experimentación se realizaron de acuerdo con el cuidado aprobado Animales institucional y protocolos de uso Comité.
1. En la perfusión in situ de los hígados de los ratones con las enzimas digestivas
- Caliente el buffer SC1 y soluciones enzimáticas de perfusión en un baño de agua a 37 ° C.
- Montar una infusión alado conjunto en el tubo de silicona de una bomba peristáltica.
- Calibrar la bomba con PBS para obtener un flujo laminar de 6.5ml/min, que es el caudal que se utilizará para el de la perfusión in situ del hígado. Equilibre el tubo de silicona con SC1 solución.
- Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y la solución de prueba de la pérdida de los reflejos para asegurar narcotización de profundidad.
- Fijar el ratón en la posición en decúbito supino sobre una base adecuada.
- Use las tijeras y pinzas para realizar una incisión longitudinal en la piel del abdomen y exponer el peritoneo.
- Abra cuidadosamente el peritoneo y mover los intestinos fuera de la cavidad abdominal en el lado izquierdo del animal con el fin de exponer la vena portal.
- Inserte la cánula de la infusión en la vena porta. Para este paso, el uso de un microscopio estereoscópico se recomienda.
- Iniciar la perfusión del hígado con una solución de 30 ml SC1. Abrir la vena cava inferior inmediatamente después de iniciar el flujo. Lavado éxito del hígado está indicado por una pérdida de color de los tejidos del hígado.
- Perfundir el hígado con una solución de 30 ml E Pronasa. Durante la digestión con éxito, los lóbulos del hígado se hinchan, y los lóbulos se parecen distintos a través de la cápsula.
- Perfundir el hígado con una solución de 30 ml de colagenasa P. El hígado en este momento ha perdido su forma y aspecto atónico y amorfo.
- Separar cuidadosamente el hígado desde el diafragma y los órganos circundantes y lo almacenan en 70 ml SC2 solución en el hielo.
- Repita el procedimiento con otros ratones.
2. En la digestión in vitro de hígados de los ratones
Todas las nuevas medidas de trabajo debe llevarse a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
- Cortar el hígado en trozos de aproximadamente 3 2x2x2mm usando unas tijeras afiladas.
- Combine la suspensión de 70 ml SC2 incluyendo las piezas de hígado con 50 ml de pronasa E-colagenasa solución P y añadir 1 ml de solución de DNasa I.
- Recopilación de los hígados de 20 minutos a 37 ° C mientras se agita.
3. Centrifugación en gradiente de densidad
- Filtrar la suspensión celular a través de filtros de 70μm de células en tubos Falcon de 50 ml 6 y añadir hasta 50 ml con buffer de SC2. Centrifugar durante 10 minutos a 600g y 4 ° C.
- Con cuidado aspirar 40 ml del sobrenadante, a continuación, añadir 150μl DNasa solución que a cada tubo y resuspender las células.
- Piscina las suspensiones de células en tubos Falcon de 50 ml 4 y lavar con GBSS-B, centrifugar durante 10 minutos a 600g y 4 ° C.
- Con cuidado aspirar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible sin perturbar el precipitado y añadir 150μl DNasa solución que a cada tubo. Resuspender los pellets de células en 10 ml GBSS-B por tubo.
- Piscina de las células en tubos Falcon de 50 ml 2 y añadir GBSS-B con un volumen total de 36ml por tubo. Añadir 14 ml solución Nycodenz a cada tubo y mezcle bien.
- Transferencia de 10 ml de la suspensión celular en un tubo de centrifugación en gradiente de 12 ml, lo que resulta en 10 tubos en total. Suavemente superposición de la suspensión celular con 1,5 ml GBSS-B por tubo.
- Centrifugar los gradientes de 15 min a 1500 g y 4 ° C sin freno. Posteriormente, los hepatocitos se sedimentan en el fondo del tubo, mientras que las células estrelladas se encuentran en la interfase como un anillo blanco.
- Con cuidado, la cosecha de la interfase que contiene las células estrelladas y los lavarás con GBSS-B, centrifugar durante 10 minutos a 600g y 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml de DMEM suplementado con 10% de SFB inactivado por calor, HEPES 1% de penicilina / estreptomicina, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 10 mM. Transferencia de las células en frascos de cultivo de tejido con una concentración de 2x10 4 células / cm 2. Se incuban las células a 37 ° C y 5% CO 2.
- Cambiar los medios de comunicación tan pronto como las células estrelladas hepáticas son adherentes (aproximadamente 2 horas después de la preparación) de lavar las células muertas y restos celulares.
- Al día siguiente, las células estrelladass debe desarrollar su característica morfología en forma de estrella con perinuclear vesículas de lípidos de almacenamiento de la vitamina A.
- Para los experimentos posteriores, las células estrelladas hepáticas pueden separarse fácilmente de las superficies de plástico sin revestimiento con leves soluciones enzimáticas como Accutase, por ejemplo,
4. Los resultados representativos:
Después de la preparación de las células estrelladas hepáticas mediante el protocolo previsto, la pureza de la población aislada se puede probar en cuenta tres características principales de este tipo de células, tales como estrellas, como la forma, las gotas de lípidos perinuclear, y la expresión de proteína ácida glial fibrilar (GFAP ). Imágenes representativas de la apariencia característica de las células estrelladas hepáticas 2h después del aislamiento de células, así como en el día 1 y 3 de cultivo in vitro se muestran en la Figura 1. La figura 2 muestra una tinción representativa de inmunofluorescencia para GFAP en las células estrelladas hepáticas, que han sido cultivadas durante 3 días después del aislamiento celular. Las células estrelladas hepáticas se diferencian en células miofibroblástico durante el cultivo in vitro. Un sello característico de las células estrelladas activadas es la expresión de alfa-actina del músculo liso (αSMA). La Figura 3 muestra la tinción de inmunofluorescencia para el Asma y la miosina II en las células estrelladas activadas en el día 7 de cultivo in vitro.
Figura 1. Morfología característica de las células estrelladas hepáticas. Las células estrelladas se aislaron de hígados de los ratones con el protocolo previsto. Las imágenes muestran 2h células estrelladas tras el aislamiento de células (a, b), así como el día 1 (c) y el día 3 (d) de cultivo in vitro. Las células estrelladas hepáticas presentan altas cantidades de vesículas de lípidos en los sitios perinuclear y adquieren su distintiva astral-como la morfología durante los primeros días de cultivo in vitro (Aumento 200x).
Figura 2. Células estrelladas hepáticas específicamente expresar GFAP en el hígado. Las células estrelladas se aislaron y immunofluorescently teñidos para GFAP (rojo) en el día 3 de cultivo in vitro. Los núcleos celulares se muestran en azul (Hoechst mancha).
Figura 3. Células estrelladas hepáticas se diferencian en miofibroblastos. Las células estrelladas hepáticas aisladas de ratones C57BL / 6 fueron cultivadas durante 7 días. Posteriormente, fueron trasladados a la cámara de diapositivas y teñidas de Asma (en rojo) y la miosina IIA (representado en verde). Los núcleos celulares fueron contrastados con Hoechst (azul).
| SC1 Buffer | |
| EGTA | 190mg |
| Glucosa | 900 mg |
| HEPES | 10 ml de solución madre 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| Rojo fenol | 6mg |
| dH 2 O | llenar hasta 1 litro |
| SC2 Buffer | |
| De CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 ml de solución madre 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| Rojo fenol | 6mg |
| dH 2 O | llenar hasta 1 litro |
| GBSS-A Buffer | |
| KCl | 370mg |
| De CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucosa | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| De MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO3 | 227mg |
| Rojo fenol | 6mg |
| dH 2 O | llenar hasta 1 litro |
| GBSS B-Buffer | |
| De CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glucosa | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| De MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO3 | 227mg |
| Rojo fenol | 6mg |
| dH 2 O | llenar hasta 1 litro |
| E pronasa perfusión Solución | |
| Pronasa E | 100 mg (4000 PU / min mg) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Colagenasa P solución de perfusión | |
| Colagenasa P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Pronasa E-colagenasa P Solución | |
| Pronasa E | 50 mg (4000 PU / min mg) |
| Colagenasa P | 85 mg (1,78 U / mg lyo) |
| SC2 Buffer | 50ml |
| DNasa I Solución | |
| DNasa I | 6 mg (2000U/mg CA) |
| GBSS-B | 3 ml |
| Nycodenz Solución | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28 ml |
Tabla 1. Tampones y soluciones de enzima requerida para el aislamiento de las células estrelladas hepáticas. El pH de todos los búferes se debe ajustar a 7,3-7,4. Además, la filtración estéril de todos los búferes se recomienda. Es importante adaptar la cantidad de enzima que se utiliza de acuerdo con la misma actividad enzimática.
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Discussion
Las células estrelladas hepáticas regular esenciales los procesos fisiológicos y fisiopatológicos en el hígado. Por otra parte, las células estrelladas poseen propiedades presentadoras de antígeno, lo que hace que un componente importante de la respuesta inmune hepática. Aunque las células estrelladas hepáticas constituyen el 10-15% del número total de células en el hígado, el aislamiento de estas células es un reto debido a su localización en el espacio perisinusoidal de Disse.
Aquí presentamos un método sencillo para aislar las células estrelladas hepáticas a partir de hígados de los ratones de la digestión in situ y posterior centrifugación en gradiente. Este protocolo permite el aislamiento de las células estrelladas de alta pureza adecuados para ensayos inmunológicos.
La entidad de las células aisladas pueden ser controlados teniendo en cuenta tres características principales de las células estrelladas hepáticas, incluyendo estrellas como la forma, la vitamina A perinuclear de almacenamiento de vesículas de lípidos, y la expresión de GFAP. De acuerdo con estos criterios, las células estrelladas obtenidos utilizando el protocolo descrito son rutinariamente ~ 99% según la evaluación de la tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo. Los contaminantes potenciales de los aislamientos de células estrelladas son las células de Kupffer y las células del hígado dendríticas (DC). Por lo tanto, se analizaron las células estrelladas culturas mediante la tinción de citometría de flujo para las moléculas de la superficie F4/80 (células de Kupffer) y CD11c (DC). En consecuencia, la ausencia de F4/80 + y CD11c + células excluido la contaminación de las preparaciones de células estrelladas por las células de Kupffer o países en desarrollo. Por lo tanto, hay métodos más enriquecimiento o de la clasificación son necesarios, lo que hace el protocolo descrito para el aislamiento de células estrelladas hepáticas de un procedimiento práctico y rápido.
En cuanto a la entidad de las células estrelladas hepáticas, es importante tener en cuenta que en las células cultivadas in vitro se activan y se diferencian en miofibroblastos que son fundamentalmente diferentes de las células estrelladas en reposo. Durante esta metamorfosis, las células estrelladas hepáticas expresión de GFAP sueltos y upregulate αSMA, que puede ser fácilmente detectado en el día 7 de cultivo in vitro. En particular, la activación de las células estrelladas in vitro se parece mucho a su patrón de activación in vivo 6. Esto se refleja en su participación en la fibrosis hepática, por ejemplo, aunque otros la producción de colágeno, las poblaciones de miofibroblastos contribuir al desarrollo de la enfermedad 7. Para concluir, las células estrelladas hepáticas obtenidas por el protocolo descrito un modelo para las células estrelladas en reposo, así como por miofibroblastos hepáticos activan en función de su etapa de diferenciación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Premio de la familia Smith a la Excelencia en la Investigación Biomédica y el NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer Flach y Melanie son compatibles con becas de doctorado de la Fundación Boehringer Ingelheim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
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