Summary
Här beskriver vi en metod för isolering av celler i levern stellate från mus lever. För stellatum cell rening, är musen lever rötas
Abstract
Nedsatt stellate celler lever hemmahörande celler av star-liknande morfologi och ligger inom loppet av spridning och annan mellan lever sinusformad endotelceller och hepatocyter 1,2. Stellate celler från benmärg prekursorer och lagra upp till 80% av kroppens totala vitamin A 1, 2. Vid aktivering stellate cellerna differentieras till myofibroblaster att producera extracellulär matrix, vilket bidrar till leverfibros 3. Baserat på deras förmåga att ingå avtal, kan myofibroblastic stellate celler reglerar kärltonus i samband med portal hypertension 4. Nyligen visade vi att levern stellate celler potenta antigenpresenterande celler och kan aktivera NKT celler och konventionella T-lymfocyter 5.
Här presenterar vi en metod för effektiv framställning av celler i levern stellate från mus lever. På grund av sin perisinusoidal lokalisering, är isolering av celler nedsatt stellate en process i flera steg. För att göra stellate celler tillgänglig för isolering från det utrymme för spridning och annan, är musen lever perfusion in situ med matsmältningsenzymer Pronase E och kollagenas P. Efter perfusion är levervävnaden genomgå ytterligare enzymatisk behandling med Pronase E och kollagenas P vitro. Därefter tar metoden nytta av den massiva mängd av vitamin A-lagring lipiddropparna i celler nedsatt stellate. Denna funktion gör att separation av stellate celler från andra typer levern celler genom centrifugering på en 8% Nycodenz lutning. Protokollet som beskrivs här ger en mycket ren och homogen population av stellate celler. Renhet av preparat kan bedömas genom färgning för markören molekylen gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) före analys av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri. Vidare avslöjar ljusmikroskopi den unika utseende stjärnformade celler i levern stellate som hyser höga halter av fett droppar.
Sammantaget presenterar vi ett detaljerat protokoll för effektiv isolering av celler lever stellatum, inklusive representativa bilder av deras morfologiska utseende och GFAP uttryck som hjälper till att definiera stellate cellen enhet.
Protocol
C57BL / 6 möss bör användas vid ~ 20 veckor eller äldre. Användningen av hanmöss som väger 25-30g rekommenderas. Avkastningen av stellate celler kan ökas genom att mata möss en A-vitamin-berikad diet för 2 månader före stellate cell isolering. Ungefär 2x10 5 nedsatt stellate celler kan renas från levern för en C57BL / 6 mus, medan avkastningen av stellate celler från BALB / c möss är betydligt högre. Följande protokoll justeras till 5 möss. Djuromsorg och experiment har utförts i enlighet med godkända stadgade Djurvård och användning protokoll kommittén.
1. In situ perfusion av mus lever med matsmältningsenzymer
- Värm SC1 buffert och enzym infusionsvätskor vid 37 ° C vattenbad.
- Montera en bevingad infusionsset på silikonslang en peristaltiska pumpar.
- Kalibrera pumpen med PBS för att få ett laminärt flöde av 6.5ml/min, vilket är flödet som kommer att användas för in situ genomblödning av levern. Jämvikt på silikonslang med SC1 lösning.
- Bedöva musen efter intraperitoneal injektion av ketamin (90 mg / kg) och Xylazine (10 mg / kg) lösning och test för förlust av reflexer för att säkerställa djupa NARKOTISERING.
- Fäst musen i ryggläge på en lämplig bas.
- Använd sax och pincett för att utföra ett längsgående snitt i buken huden och exponera bukhinnan.
- Öppna försiktigt bukhinnan och flytta tarmarna ur bukhålan på vänster sida av djuret för att exponera portalen ven.
- Sätt in kanylen i infusionssetet till portalen ven. I detta steg är användningen av ett stereomikroskop rekommenderas.
- Starta perfusion av levern med 30ml SC1 lösning. Öppna vena cava inferior omedelbart efter påbörjad flödet. Framgångsrik spolning av levern indikeras av en förlust av färg i levern vävnad.
- BEGJUTA levern med 30ml Pronase E lösning. Vid lyckad matsmältning, kommer levern loberna sväller, och lobules visas distinkt genom kapseln.
- BEGJUTA levern med 30ml kollagenas P lösning. Levern på denna punkt har förlorat sin form och ser atoniska och amorfa.
- Separera försiktigt levern från membranet och omgivande organ och förvara den i 70ml SC2 lösningen på is.
- Upprepa proceduren med alla de möss.
2. In vitro rötning av mus lever
Alla ytterligare arbetsmoment skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva.
- Skär lever i bitar på ca 2x2x2mm 3 med vass sax.
- Kombinera upphävandet av 70ml SC2 inklusive lever bitar med 50 ml Pronase E-kollagenas P lösning och tillsätt 1 ml DNase jag lösning.
- Smälta lever för 20min vid 37 ° C under omrörning.
3. Densitetsgradient centrifugering
- Filtrera cellsuspension genom 70μm cellen silar in 6 50ml Falcon rör och lägga till upp till 50 ml med SC2 buffert. Centrifugera i 10min på 600g och 4 ° C.
- Försiktigt aspirera 40 ml av supernatanten, lägg sedan till 150μl DNas Jag lösning till varje rör och suspendera cellerna.
- Pool på cellsuspensioner i 4 50ml Falcon rör och tvätta med GBSS-B, centrifugera i 10min på 600g och 4 ° C.
- Försiktigt aspirera så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelleten och lägga 150μl DNas Jag lösning till varje rör. Resuspendera cellen pellets i 10ml GBSS-B per rör.
- Pool cellerna i 2 50ml Falcon rör och tillsätt GBSS-B till en total volym av 36ml per rör. Tillsätt 14ml Nycodenz lösning till varje rör och blanda väl.
- Överför 10 ml av cellsuspensionen i en 12ml gradient centrifugering röret, vilket resulterar i 10 rör totalt. Försiktigt överlägg cellsuspensionen med 1,5 ml GBSS-B per rör.
- Centrifugera gradienter för 15min på 1500g och 4 ° C utan broms. Därefter kommer hepatocyter att pelleterat i botten av röret medan stellate celler finns i faserna som en vit ring.
- Försiktigt skörd mellan faserna innehåller stellate cellerna och tvätta dem med GBSS-B, centrifugera i 10min på 600g och 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 20ml DMEM kompletterad med 10% värmeinaktiveras FBS, 1% Penicillin / streptomycin, 2mm L-glutamin, 1mm natrium pyruvat, och 10 mm HEPES. Överför cellerna i kolvar vävnadskultur med en koncentration på 2x10 4 celler / cm 2. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Ändra media så fort det hepatiska stellate celler anhängare (ca 2h efter beredningen) för att tvätta bort döda celler och smuts.
- Dagen därpå, den stellate cellenar bör utveckla sin karaktäristiska stjärnformade morfologi med perinukleära vitamin A-lagring lipid blåsor.
- För efterföljande experiment, kan nedsatt stellate celler lätt kopplas loss från icke-belagda plastytor med mild enzymatiska lösningar såsom Accutase, t.ex.
4. Representativa resultat:
Efter beredning av celler lever stellate använder protokollet som kan renheten i den isolerade befolkningen testas med tanke på tre viktiga egenskaper för denna celltyp, såsom Star-liknande form, perinukleära droppar fett, och uttryck av stödjeceller fibrillära surt protein (GFAP ). Representant bilder för karaktäristiska utseendet av celler i levern stellate 2h efter cell isolering, samt på dag 1 och 3 i in vitro-kultur är avbildade i figur 1. Figur 2 visar ett representativt immunofluorescens färgning av GFAP i celler nedsatt stellatum, som har odlats i 3 dagar efter cell isolering. Nedsatt stellate cellerna differentieras till myofibroblastic celler under in vitro kultur. Ett karakteristiskt kännetecken av dessa aktiverade stellate celler är uttrycket av alfa glatt muskulatur aktin (αSMA). Figur 3 visar immunofluorescens färgning för ASMA och myosin IIA i aktiverade stellate celler på dag 7 av in vitro-kultur.
Figur 1. Karakteristisk morfologi av celler i levern stellate. Stellate celler isolerade från mus lever som använder protokollet tillhandahålls. Bilderna visar stellate celler 2h efter cell isolering (a, b), samt på dag 1 (c) och dag 3 (d) i in vitro kultur. Nedsatt stellate celler uppvisar höga halter av lipider blåsor vid perinukleära platser och får sin särpräglade astral-liknande morfologi under de första dagarna av in vitro-kultur (Förstoring 200x).
Figur 2. Nedsatt stellate celler uttrycker specifikt GFAP i levern. Stellate celler var isolerade och immunofluorescently färgas för GFAP (röd) på dag 3 av in vitro-kultur. Cellkärnan avbildas i blått (Hoechst fläcken).
Figur 3. Lever stellate cellerna differentieras till myofibroblaster. Nedsatt stellate celler som isolerats från C57BL / 6 möss odlades i 7 dagar. Därefter var de överfördes till kammaren diabilder och färgas för ASMA (visas i rött) och myosin IIA (avbildad i grönt). I cellkärnan var counterstained med Hoechst (blå).
| SC1 Buffer | |
| EGTA | 190mg |
| Glukos | 900mg |
| HEPES | 10 ml 1M stamlösning |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Fenolrött | 6 mg |
| dH 2 O | Fyll upp till 1l |
| SC2 Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 ml 1M stamlösning |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Fenolrött | 6 mg |
| dH 2 O | Fyll upp till 1l |
| GBSS-En buffert | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glukos | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30 mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70 mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75 mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Fenolrött | 6 mg |
| dH 2 O | Fyll upp till 1l |
| GBSS-B Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glukos | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30 mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70 mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75 mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Fenolrött | 6 mg |
| dH 2 O | Fyll upp till 1l |
| Pronase E perfusion lösning | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU / mg min) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Kollagenas P perfusion lösning | |
| Kollagenas P | 85mg (1,78 U / mg Lyo) |
| SC2 Buffer | 200ml |
| Pronase E-kollagenas P Lösning | |
| Pronase E | 50 mg (4000 PU / mg min) |
| Kollagenas P | 85mg (1,78 U / mg Lyo) |
| SC2 Buffer | 50ml |
| DNas Jag Solution | |
| DNas jag | 6 mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz Lösning | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tabell 1. Buffertar och lösningar enzym som krävs för isolering av celler i levern stellate. PH-värdet i alla buffertar bör justeras till 7,3-7,4. Dessutom är steril filtrering av alla buffertar rekommenderas. Det är viktigt att anpassa den mängd enzym som används enligt given enzymaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nedsatt stellate celler reglerar grundläggande fysiologiska och patofysiologiska processer i levern. Dessutom stellate celler har antigenpresenterande egenskaper gör dem en viktig del av nedsatt immunsvar. Även nedsatt stellate cellerna utgör 10-15% av det totala antalet celler i levern, är isolering av dessa celler utmanande på grund av sin lokalisering i perisinusoidal loppet av spridning och annan.
Här presenterar vi en enkel metod att isolera celler nedsatt stellate från mus lever med in situ matsmältningen och efterföljande gradient centrifugering. Detta protokoll möjliggör isolering av mycket ren stellate celler som lämpar sig för immunologiska analyser.
Den enhet av de isolerade cellerna kan kontrolleras med tanke på tre viktiga egenskaper hos celler lever stellatum, inklusive stjärnliknande form, perinukleära vitamin A-lagring blåsor lipid och uttryck av GFAP. Enligt dessa kriterier, stellate celler erhålls med de beskrivna protokollet rutinmässigt ~ 99% enligt bedömning av immunofluorescens färgning och flödescytometri. Potentiella föroreningar av stellate cell isoleringar är Kupfferceller och leverceller dendritiska (DCS). Därför analyserade vi stellate cellkulturer med flödescytometri färgning av ytan molekyler F4/80 (Kupfferceller) och CD11c (DCS). Därför saknas F4/80 + och CD11c + celler uteslutas förorening av stellate cell förberedelser Kupfferceller eller DCS. Därför finns inga ytterligare anrikning eller sortering metoder som krävs, vilket gör det beskrivna protokollet för nedsatt stellate cell isolering ett bekvämt och snabbt förfarande.
När det gäller den enhet av celler nedsatt stellatum, är det viktigt att komma ihåg att in vitro-odlade celler blir aktiverade och differentierar till myofibroblaster som i grunden skiljer sig från vilande stellate celler. Under denna metamorfos, nedsatt stellate celler löst uttryck av GFAP och upregulate αSMA, som lätt kan upptäckas på dag 7 av in vitro-kultur. Särskilt liknar aktivering av stellate in vitro starkt deras aktivering mönster in vivo 6. Detta återspeglas i deras engagemang i leverfibros, till exempel, om än andra kollagen-producerande myofibroblast populationer bidrar till sjukdomens utveckling 7. Avslutningsvis nedsatt stellate celler erhålls genom den beskrivna protokollet skapa en modell för rofylld stellate celler samt för aktiverade lever myofibroblaster beroende på deras differentiering scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av familjen Smith Award for Excellence inom biomedicinsk forskning och NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer och Melanie Flach stöds av PhD stipendier från Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
