Summary
In newt, regeneriert die Linse immer von der dorsalen Iris durch Transdifferenzierung der Iris pigmentierten Epithelzellen (IPE). Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kultur dorsalen und ventralen newt IPE Zellen und deren Implantation der Molch Auge. Die implantierten Zellen werden dann durch Gewebe Schnitte und Immunhistochemie untersucht.
Abstract
Salamander wie Newt Axolotl besitzen die Fähigkeit, viele seiner verlorenen Körperteile wie Beine, der Schwanz mit Rückenmark, Augen, Gehirn, Herz, die Backe 1 regenerieren. Insbesondere sind Molche einzigartig für seine Linse Regenerationsfähigkeit. Nach Linse entfernt, IPE Zellen der dorsalen Iris-Objektiv Zellen transdifferenzieren und bilden schließlich eine neue Linse in etwa einem Monat 2,3. Diese Eigenschaft der Regeneration wird nie von der ventralen Iris Zellen zeigten. Die Regenerationsfähigkeit der Iris-Zellen können, indem Transplantation von in vitro kultivierten Zellen IPE untersucht werden. Für die Kultur sind die dorsalen und ventralen Iris Zellen zunächst aus dem Auge isoliert und separat für einen Zeitraum von 2 Wochen (Abbildung 1) kultiviert. Diese gezüchteten Zellen werden neu zusammengefügt und wieder auf das Newt Auge implantiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die dorsale reaggregieren seiner Linse bilden Kapazität behält, während die ventralen Aggregat der keinen Linse, rekapitulieren, damit die in vivo-Verfahren (Abb. 2) 4,5. Dieses System zur Bestimmung Regenerationsfähigkeit der dorsalen und ventralen Iris-Zellen ist sehr nützlich bei der Untersuchung der Rolle von Genen und Proteinen in der Linse Regeneration beteiligt.
Protocol
1. Iris Cell Culture
- Sammeln Augäpfel von 7 Molche (narkotisierten in 0,1% Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonsäure in PBS) hergestellt und in Calcium-Magnesium-freier Hanks-Lösung (CMF).
- Wechseln Sie die Handschuhe und die Arbeit in der Gewebekultur Kapuze.
- Sterilisieren Augäpfel in Lugol-EtOH für 3 Sekunden.
- Wash 2 Mal in CMF.
- Transfer Augen Hanks und beginnen Dissektion.
- Dissect Iris-Hornhaut-Komplex und entfernen neuronalen Netzhaut.
- Transfer-Komplexe in ein neues Gericht von Hanks.
- Mit Nr. 15 Skalpell, separate Komplexe in dorsalen und ventralen Hälften.
- Entfernen Iris-Fragmente (ventral zuerst) und in eine Schüssel mit 1 ml L-15.
- Fügen Sie 15% (150 ul) Volumen von Dispase (7,5 Einheiten / ml Konzentration).
- Inkubation bei 27 ° C für 2 Stunden (wrap Schale mit Parafilm).
- Isolieren IPE Zellen von Stroma (Place Trypsin-Lösung bei 27 ° C).
- Sammeln IPE Zellen in ein 1,5 ml-Tube.
- Zentrifugation bei 1000 rpm bei RT (Raumtemperatur) für 2 Minuten, entfernen Überstand.
- Waschen mit 1 ml Hanks und Zentrifuge bei 1000 rpm bei RT für 2 Minuten, Überstand entfernen.
- 1 ml Trypsin-Lösung; inkubieren für 2 Stunden bei 27 ° C.
- Zentrifugation bei 1000 rpm bei RT für 2 Minuten, entfernen Trypsin.
- 1 ml L-15 zu waschen, zentrifugieren bei 1000 rpm für 2 Minuten.
- Add 800 ul L-15, Pipette langsam auf und ab ~ 10-mal (mehr als 12 Mal reduziert Haftung).
- Platte der IPE Zellen auf einem 24-Well-Kollagen beschichtete Platte und inkubieren bei 27 ° C für 2 Wochen (in der Regel, 4 dorsalen und 4 ventralen Brunnen sind zwischen 7 und Molche erhalten).
- In diesem Stadium Zellen eignen sich für die Gen-Transfektion oder die Behandlung mit Faktoren, um ihre Rolle bei der Induktion oder stören Objektiv Regeneration zu bestimmen.
2. Aggregation von Iris Cells
- Um die Platten mit Iris-Zellen add 20 &mgr; l der Dispase-Lösung zu 400 ul Medium, vorsichtig schwenken.
- Die Platten bei 27 ° C über Nacht.
- Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zu verdrängen Zellen
- Legen Sie Zellen in Eppendorf-Röhrchen und Spin 2 Minuten bei 1000 rpm bei RT.
- Nehmen Sie mittel-und waschen durch Zugabe von 1 ml komplette L-15, Spin 2 Minuten bei 1000 rpm bei RT, entfernen Medium.
- Verwenden 2000-7000 Zellen pro Aggregat. Geben Sie 200 ul L-15 pro Aggregat in jedes Röhrchen.
- Split-Zellen (200 ul) in neue Eppendorf-Röhrchen.
- Spin bei 1000 rpm für 2 min bei RT.
- Inkubieren für 48 Stunden bei 27 ° C.
3. Die Implantation von Aggregrated Cells
- Machen Sie einen Schlitz in die Hornhaut des Auges newt und entfernen Sie die Linse.
- Nach Linse entfernt, legen Sie die IPE Zellverbandes knapp unterhalb der Hornhaut auf der Bauchseite des Auges.
- Die Molche sind für einen Monat aufbewahrt, damit sie regenerieren die Linse.
4. Einbettung von Newt Eye
- Entfernen Sie den Molch Augen mit dem Aggregat implantiert und legen Sie sie in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Fix in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht.
- Wash in PBS, 4 ° C für 30 Minuten.
- Behandeln Sie es mit 0,85% iger Kochsalzlösung: 4 ° C, 30 Minuten.
- Wash in Saline / Ethanol (1:1): RT für 15 Minuten.
- Wash in 70% Ethanol: RT, 15 Minuten. Wiederholen Sie es einmal.
- Wash in 85% Ethanol und 95% Ethanol bei RT, 30 Minuten
- Wash in 100% Ethanol: RT, 30 Minuten. Wiederholen Sie es einmal.
- Lagerung bei 4 ° C oder fortzusetzen.
- Wash in 100% Xylol: RT, 30 Minuten. Wiederholen Sie es einmal.
- Behandeln Sie mit Xylol / Paraffin (1:1): 60 ° C, 45 Minuten.
- Behandeln Sie mit 100% Paraffin: 60 ° C, 20 Minuten. Wiederholen Sie es noch zwei weitere Male.
- Embed in Einbettformen.
5. Sectioning
- Bereiten 15 um Abschnitte der embedded Auge mit Hilfe eines Mikrotoms.
- Legen Sie das Auge Abschnitte auf einer Gelatine beschichtete Folie und lassen Sie es auf einer Folie wärmer.
6. Die Färbung
- Die Objektträger in Xylol für 10 Minuten. Wiederholen Sie es noch einmal.
- Hydrate in: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% Ethanol für jeweils 1 Minute
- Spülen in DI-Wasser für eine Minute.
- Wash in PBS für 15 Minuten.
- Wash in PBST (0,2% Triton-X 100 in PBS) für 15 Minuten.
- Wash in PBS für 15 Minuten.
- Legen Sie in Blocking-Lösung (10% Ziegenmilch sekundärer Antikörper) für eine Stunde.
- Legen Sie in primärer Antikörper zur Übernachtung.
- Wash primärer Antikörper in PBS für 15 Minuten.
- Wash in PBST für 15 Minuten.
- Wash in PBS für 15 Minuten.
- Legen Sie in sekundären Antikörper für 2 Stunden in dunklen (1:100 Verdünnung in PBS).
- Wash in PBS, PBST und PBS für jeweils 15 Minuten und dann montieren.
- Den Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Dieses Verfahren zur Kultivierung newt irist Zellen wurde verwendet, um die Regenerationsfähigkeit der dorsalen und der ventralen IPE Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus ist es auch möglich, spezielle Gene, die in Richtung des Objektivs Regeneration Mechanismus in newt Auge beitragen zu studieren. Wenn die Zellen für 2 Wochen kultiviert wurden (Abbildung 1) können sie von den Genen transfiziert werden, um ihre Funktion in der Linse Regeneration zu untersuchen. Von besonderem Interesse sind Gene, die die ventralen Iris induzieren könnte. Da die ventralen Iris Zellen können nicht auf die Linse transdifferenzieren (Abbildung 2) die induktive Funktion eines Kandidatengen untersucht werden können. In der Vergangenheit mit dieser Technik haben wir gezeigt, dass, wenn sechs-3 über wurde in Anwesenheit von Retinsäure Objektiv Induktion exprimiert wurde von der ventralen Iris 6 beobachtet. In Abbildung 3 sehen wir, dass der ventralen Iris aggregierten Anstieg gab ein ausgewachsener und differenzierte Linse (Pfeilspitze), nicht anders als die Host-Objektiv aus dem dorsalen Iris (Pfeil).
Abbildung 1. a) Dorsal Iris pigmentierten Epithelzellen in vitro für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert. b) Ventrale Iris pigmentierten Epithelzellen in vitro für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert. Beachten Sie, dass Pigmentierung dieser Phase besteht in beiden dorsalen und ventralen Iris-Zellen.
Abbildung 2. Regenerationsfähigkeit von kultivierten IPE Zellen. a) Objektiv Induktion von dorsal IPE Zellverband (Pfeilspitze). Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil), di: dorsale Iris, vi: ventral Iris le: Linsenepithel, lf: Linsenfasern. b) Fehlen der Linse Induktion von ventral IPE Zellverband (Pfeilspitze). Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil).
Abbildung 3. Objektiv Induktion von ventral Aggregat mit sechs-3 transfiziert und mit Retinsäure. Host-Objektiv Induktion von dorsal Iris (Pfeil). Objektiv Induktion von ventral Aggregat (Pfeilspitze).
Discussion
Dieses Protokoll wurde ein in vitro System zur Linse Regeneration Mechanismen in Molche Studie etabliert. Da die Aggregate (entweder dorsal oder ventral treu zu folgen ihren in vivo-Verhalten während der Regeneration dieser Technik kann der enorme Aufwand für Transgenese in Molche erforderlich und kann für gain of function sowie Verlust der Funktion Experimente 7,8,9 verwendet werden zu lindern. Auch können die Aggregate oder die Iris als Ganzes leicht mit Wachstumsfaktoren behandelt und untersucht deren Auswirkungen, wie in diesem Protokoll beschrieben. Zum Beispiel die Rolle der BMP-Weg wurde untersucht mit dieser Technik 6.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein NIH Ey10540 zu PAT finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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