Summary
Em newt, a lente regenera sempre a partir da íris dorsal pela transdiferenciação das células epiteliais pigmentadas da íris (EPIs). Aqui nós descrevemos um procedimento para células de cultura dorsal e ventral newt IPE e sua implantação para o olho newt. As células são então implantados estudado por corte de tecido e imuno-histoquímica.
Abstract
Salamandras como newt e axolotl possuem a capacidade de regenerar muitas de suas partes do corpo perdidas, como membros, a cauda com medula espinhal, olhos, cérebro, coração, mandíbula 1. Especificamente, salamandras são únicos pela sua capacidade de regeneração da lente. Após a remoção da lente, IPE células da íris dorsal transdifferentiate para as células da lente e, eventualmente, formar uma nova lente em cerca de um mês 2,3. Esta propriedade de regeneração nunca é exibido por células ventral da íris. O potencial de regeneração das células da íris pode ser estudado, fazendo transplantes de células cultivadas in vitro IPE. Para a cultura, as células dorsal e ventral da íris são primeiramente isoladas do olho e cultivadas separadamente para um período de duas semanas (Figura 1). Estas células são cultivadas e implantadas avaliação reagregada de volta para o olho newt. Estudos anteriores mostraram que o reaggregate dorsal mantém a sua capacidade de lente formando enquanto o agregado ventral não formar uma lente, sintetizando, assim, o processo em vivo (Figura 2) 4,5. Este sistema de determinação do potencial de regeneração de células dorsal e ventral da íris é muito útil para estudar o papel dos genes e proteínas envolvidos na regeneração da lente.
Protocol
1. Iris Cultura de Células
- Colete globos oculares de 7 newts (anestesiados em 0,1% etílico 3-aminobenzoato de ácido metano sulfônico preparado em PBS) e coloque em cálcio, magnésio livre Hanks solução (CMF).
- Mudar de luvas e trabalhar no bairro de cultura de tecidos.
- Esterilizar bolas olho em Lugol's-EtOH por 3 segundos.
- Lavar 2 vezes em CMF.
- Transferência olhos para Hanks e começar a dissecção.
- Dissecar-íris da córnea complexa e remover retina neural.
- Transferência de complexos em um novo prato de Hanks.
- Utilizando bisturi # 15, complexos separados em metades dorsal e ventral.
- Remover fragmentos íris (ventral primeiro) e coloque em um prato contendo 1 ml L-15.
- Adicionar 15% (150 ul) volume de dispase (7,5 unidades / ml de concentração).
- Incubar a 27 ° C por 2 horas (wrap prato com parafilme).
- Isolar as células do estroma IPE (solução Coloque tripsina a 27 ° C).
- Coletar células IPE em um tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 1000 rpm em temperatura ambiente (temperatura ambiente) por 2 minutos, retire o sobrenadante.
- Lave com 1 ml Hanks e centrifugar a 1000 rpm em temperatura ambiente por 2 minutos, retire o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de solução de tripsina; incubar por 2 horas a 27 ° C.
- Centrifugar a 1000 rpm em temperatura ambiente por 2 minutos, retire tripsina.
- Adicionar 1 ml L-15 para lavar, centrifugar a 1000 rpm por 2 minutos.
- Adicionar 800 ul L-15, pipeta lentamente para cima e para baixo ~ 10 vezes (mais de 12 vezes reduz a aderência).
- Placa IPE as células em um prato de colágeno 24 revestido bem e incubar a 27 ° C por 2 semanas (geralmente, 4 dorsal e ventral 4 poços são obtidos a partir de 7 newts).
- Nesta fase as células são adequados para a transfecção de genes ou tratamento com fatores para determinar seu papel na indução ou interferir com a regeneração da lente.
2. Agregação de células Iris
- Para as placas contendo as células da íris adicionar 20μl de solução dispase a 400 mL médio, homogeneizar suavemente.
- Incubar as placas a 27 ° C para pernoite.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo para retirar as células
- Células lugar em Eppendorf tubo e girar durante 2 minutos a 1000 rpm em temperatura ambiente.
- Remova o meio e lavar, adicionando 1 ml L-15 completa, spin 2 minutos a 1000 rpm em temperatura ambiente, remova o meio.
- Use 2000-7000 células por agregado. Adicione 200 ul L-15 por agregar em cada tubo.
- Dividir células (200 mL) em tubos eppendorf novo.
- Giram a 1000 rpm por 2 min à temperatura ambiente.
- Incubar por 48 horas a 27 ° C.
3. Implantação de células de agregação
- Fazer um corte na córnea do olho de salamandra e remover as lentes.
- Após a remoção da lente, coloque o agregado de células IPE, logo abaixo do tecido da córnea no lado ventral do olho.
- Os tritões são mantidos por um mês para deixá-los regenerar a lente.
4. Incorporação de Olho Newt
- Remove os olhos newt implantado com o agregado e colocá-lo em tampão fosfato salino (PBS).
- Fix em paraformaldeído 4% a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite.
- Lavar em PBS, 4 ° C por 30 minutos.
- Tratá-lo com solução salina a 0,85%: 4 ° C, 30 minutos.
- Lave em Saline / etanol (1:1): RT por 15 minutos.
- Lavar em etanol 70%: RT, 15 minutos. Repeti-lo uma vez.
- Lavar em etanol 85% e 95% de etanol à temperatura ambiente, 30 minutos cada
- Lavar em etanol 100%: RT, 30 minutos. Repeti-lo uma vez.
- Armazenar a 4 ° C ou continuar.
- Lavar em 100% xileno: RT, 30 minutos. Repeti-lo uma vez.
- Tratar com xilol / parafina (1:1): 60 ° C, 45 minutos.
- Tratar com parafina de 100%: 60 ° C, 20 minutos. Repeti-lo mais duas vezes.
- Incorporar em moldes de incorporação.
5. Seccionamento
- Prepare 15 seções M do olho incorporado usando um micrótomo.
- Coloque as seções olho em uma lâmina revestida de gelatina e deixe-a um aquecedor de slides.
6. Coloração
- Coloque as lâminas em xilol por 10 minutos. Repeti-la mais uma vez.
- Hidrate em: 100%, 95%, 80%, 70%, etanol 30% por 1 minuto cada
- Enxágüe em água DI por um minuto.
- Lavar em PBS por 15 minutos.
- Lave em PBST (0,2% Triton-X 100 em PBS) por 15 minutos.
- Lavar em PBS por 15 minutos.
- Lugar em solução de bloqueio (anticorpo de cabra 10% secundário) por uma hora.
- Lugar em anticorpo primário para pernoite.
- Lavar anticorpo primário em PBS por 15 minutos.
- Lave em PBST por 15 minutos.
- Lavar em PBS por 15 minutos.
- Lugar em anticorpo secundário por 2 horas no escuro (diluição 1:100 em PBS).
- Lavar em PBS, PBST e PBS por 15 minutos cada e depois montar.
- Observe as lâminas no microscópio de fluorescência.
7. Resultados representativos:
Este procedimento de cultivo newt irsão as células tem sido utilizada para estudar o potencial de regeneração da dorsal e as células ventral IPE. Além disso, também é possível estudar os genes específicos que contribuem para o mecanismo de regeneração da lente no olho do newt. Quando as células foram cultivadas por duas semanas (Figura 1) podem ser transfectadas por genes para examinar a sua função na regeneração da lente. De particular interesse são genes que poderiam induzir a íris ventral. Uma vez que as células ventral da íris não pode transdifferentiate a lente (Figura 2) a função de indutor de um gene candidato pode ser estudada. No passado, usando esta técnica nós mostramos que quando seis-3 foi mais expressa na presença de ácido retinóico lente de indução foi observado a partir da íris ventral 6. Na Figura 3 podemos ver que o agregado íris ventral deu origem a uma lente completamente crescido e diferenciados (seta), não diferente do que a lente de host da íris dorsal (seta).
Figura 1. a) Dorsal células epiteliais pigmentadas da íris cultivadas in vitro por um período de duas semanas. b) Ventral células epiteliais pigmentadas da íris cultivadas in vitro por um período de duas semanas. Note-se que a pigmentação persistir a este estágio em células dorsal e ventral da íris.
Figura 2. Capacidade de regeneração de células cultivadas IPE. a) indução Lente de agregados de células dorsal IPE (seta). Anfitrião indução lente de íris dorsal (seta), di: iris dorsal, vi: iris ventral, le: epitélio da lente, lf: fibras da lente. b) Ausência de indução de lente de agregados de células ventral IPE (seta). Anfitrião indução lente de íris dorsal (seta).
Figura 3. Indução lente de agregados ventral transfectadas com seis-3 e tratadas com ácido retinóico. Anfitrião indução lente de íris dorsal (seta). Indução lente de agregados ventral (seta).
Discussion
Este protocolo estabeleceu um sistema in vitro para estudar mecanismos de regeneração lente em salamandras. Uma vez que os agregados (ou dorsal ou ventral seguir fielmente os seus no comportamento in vivo durante a regeneração esta técnica pode aliviar o tremendo esforço necessário para transgenia em tritões e pode ser utilizado para ganho de função, bem como perda da função experimentos 7,8,9. Também , dos agregados ou a íris como um todo pode ser facilmente tratada com fatores de crescimento e examinar os seus efeitos, conforme descrito neste protocolo. Por exemplo, o papel da BMP caminho tem sido estudada utilizando esta técnica 6.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa NIH Ey10540 a PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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