Summary
Dans le triton, l'objectif se régénère toujours à partir de l'iris par transdifférenciation dorsale de l'iris des cellules épithéliales pigmentées (IPE). Nous décrivons ici une procédure de cellules en culture Newt dorsale et ventrale IPE et leur implantation à l'oeil triton. Les cellules implantées sont ensuite étudiées par le sectionnement des tissus et immunohistochimie.
Abstract
Salamandres, comme le triton et l'axolotl possède la capacité de régénérer la plupart de ses pièces de corps perdus tels que des branches, la queue avec la moelle épinière, des yeux, du cerveau, du cœur, la mâchoire 1. Plus précisément, les tritons sont uniques pour ses capacités de régénération de l'objectif. Après retrait du cristallin, cellules IPE de la dorsale de l'iris transdifférencier aux cellules du cristallin et finissent par former une nouvelle lentille en un mois environ 2,3. Cette propriété de la régénération n'est jamais exposées par les cellules de l'iris ventral. Le potentiel de régénération des cellules de l'iris peut être étudiée en faisant des greffes de cellules cultivées in vitro de l'IPE. Pour la culture, les cellules dorsales et ventrales de l'iris sont d'abord isolés de l'œil et cultivées séparément pendant une période de 2 semaines (figure 1). Ces cellules cultivées sont reaggregated et implanté à l'œil triton. Des études antérieures ont montré que la réagréger dorsale maintient sa capacité lentilles formant alors l'agrégat ventrale ne forme pas un objectif, récapitulant, donc le procédé in vivo (figure 2) 4,5. Ce système de détermination de potentiel de régénération des cellules de l'iris dorsale et ventrale est très utile pour étudier le rôle des gènes et des protéines impliquées dans la régénération de l'objectif.
Protocol
1. Culture cellulaire Iris
- Recueillir globes oculaires de 7 tritons (anesthésiés dans 0,1% éthyl 3-aminobenzoate d'acide méthane sulfonique préparée dans du PBS) et le lieu en calcium magnésium libre solution de Hanks (CMF).
- Changer de gants et de travailler dans la hotte de culture de tissus.
- Stériliser globes oculaires dans le Lugol-EtOH pendant 3 secondes.
- Laver 2 fois au FCM.
- Transfert aux yeux Hanks et commencer la dissection.
- Disséquer l'iris-cornéen complexes et enlever rétine neurale.
- Transfert complexes dans un nouveau plat de Hanks.
- Utiliser # 15 scalpel, complexes séparés en deux moitiés dorsale et ventrale.
- Enlever les fragments de l'iris (ventrale en premier) et placer dans un plat contenant 1 ml de L-15.
- Ajouter 15% (150 ul) volume de dispase (7,5 unités / ml de concentration).
- Incuber à 27 ° C pendant 2 heures (plat envelopper avec du parafilm).
- Isoler les cellules du stroma IPE (solution de trypsine Placez à 27 ° C).
- Recueillir les cellules IPE dans un tube de 1,5 ml.
- Centrifuger à 1000 rpm à température ambiante (température ambiante) pendant 2 minutes, retirer le surnageant.
- Laver avec 1 ml Hanks et centrifuger à 1000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes, retirer le surnageant.
- Ajouter 1 ml solution de trypsine; incuber pendant 2 heures à 27 ° C.
- Centrifuger à 1000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes, retirez la trypsine.
- Ajouter 1 ml de L-15 de se laver, centrifugeuse à 1000 rpm pendant 2 minutes.
- Ajouter 800 ul L-15, pipette lentement de haut en bas ~ 10 fois (plus de 12 fois réduit l'adhérence).
- Assiette des cellules IPE sur une plaque 24 de collagène bien enrobées et incuber à 27 ° C pendant 2 semaines (habituellement, quatre dorsales et ventrales 4 puits sont obtenus à partir de 7 tritons).
- A ce stade, les cellules sont adaptées pour la transfection de gènes ou d'un traitement avec des facteurs afin de déterminer leur rôle dans l'induction de la régénération ou à interférer avec l'objectif.
2. Agrégation des cellules Iris
- Pour les plaques contenant des cellules de l'iris ajouter 20 pi de solution dispase à 400 pl de milieu, remuer doucement.
- Incuber les plaques à 27 ° C pour la nuit.
- Pipet doucement de haut en bas pour déloger les cellules
- Placer dans les cellules du tube Eppendorf et de spin 2 minutes à 1000 rpm à température ambiante.
- Retirer et laver moyennes en ajoutant 1 ml de L-15 complète, spin 2 minutes à 1000 rpm à RT, éliminer le milieu.
- Utilisez 2000-7000 cellules par agrégat. Ajouter 200 ul L-15 par agrégat dans chaque tube.
- Fractionner les cellules (200 pi) dans des tubes Eppendorf de nouvelles.
- Centrifuger à 1000 rpm pendant 2 min à température ambiante.
- Incuber pendant 48 heures à 27 ° C.
3. L'implantation de cellules Aggregrated
- Faire une fente dans la cornée de l'œil de triton et retirez l'objectif.
- Après retrait du cristallin, placer l'agrégat de cellules IPE juste en dessous du tissu cornéen sur la face ventrale de l'œil.
- Les tritons sont conservés pendant un mois pour leur faire régénérer la lentille.
4. Intégration des yeux Newt
- Retirez les yeux Newt implanté à l'agrégat et le placer dans un tampon phosphate salin (PBS).
- Fixer dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou jusqu'au lendemain.
- Laver dans du PBS, 4 ° C pendant 30 minutes.
- Traitez-le avec une solution saline 0,85%: 4 ° C, à 30 minutes.
- Laver à Saline / éthanol (1:1): RT pendant 15 minutes.
- Laver à l'éthanol 70%: RT, à 15 minutes. Répétez une fois.
- Laver à l'éthanol 85% et 95% d'éthanol à température ambiante, 30 minutes chacune
- Laver à l'éthanol à 100%: RT, à 30 minutes. Répétez une fois.
- Conserver à 4 ° C ou de continuer.
- Laver à 100% du xylène: RT, à 30 minutes. Répétez une fois.
- Traitez-les avec du xylène / paraffine (1:1): 60 ° C, à 45 minutes.
- Traiter avec de la paraffine à 100%: 60 ° C, à 20 minutes. Répétez ce deux fois plus.
- Intégrer dans l'intégration des moules.
5. Sectionnement
- Préparer 15 sections um de l'œil embarqué utilisant un microtome.
- Placez les sections oeil sur une lame de gélatine couché et le laisser sur le réchauffement de diapositives.
6. Coloration
- Placer les lames dans le xylène pendant 10 minutes. Répétez encore une fois.
- Hydratez dans: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% d'éthanol pendant 1 minute de chaque
- Rincer à l'eau DI pendant une minute.
- Laver dans du PBS pendant 15 minutes.
- Laver dans du PBST (0,2% de Triton-X 100 dans du PBS) pendant 15 minutes.
- Laver dans du PBS pendant 15 minutes.
- Placer dans la solution de blocage (anticorps de chèvre 10% du secondaire) pendant une heure.
- Placer dans l'anticorps primaire pour la nuit.
- Lavez anticorps primaire dans du PBS pendant 15 minutes.
- Laver dans du PBST pendant 15 minutes.
- Laver dans du PBS pendant 15 minutes.
- Placer dans anticorps secondaire pendant 2 heures dans l'obscurité (1:100 dilution en PBS).
- Laver dans du PBS, PBST et PBS pendant 15 minutes chacun, puis monter.
- Observez la glisse sous un microscope à fluorescence.
7. Les résultats représentatifs:
Cette procédure de mise en culture Newt irn'est cellules a été utilisée pour étudier le potentiel de régénération de la dorsale et les cellules ventrales IPE. Par ailleurs, il est également possible d'étudier les gènes spécifiques qui contribuent à l'objectif de mécanisme de régénération dans l'oeil de triton. Lorsque les cellules ont été cultivées pendant 2 semaines (figure 1) ils peuvent être transfectées par des gènes d'examiner leur fonction dans la régénération de l'objectif. D'intérêt particulier sont les gènes qui pourraient induire l'iris ventral. Puisque les cellules ventrales iris ne peut pas transdifférencier à la lentille (figure 2) la fonction d'induction d'un gène candidat peut être étudiée. Dans le passé, en utilisant cette technique, nous avons montré que lorsque six-3 a été surexprimé dans la présence de l'induction de l'acide rétinoïque lentilles a été observée à partir de la ventrale de l'iris 6. Dans la figure 3, nous pouvons voir que l'ensemble de l'iris ventrale a donné lieu à une lentille entièrement développé et différenciées (tête de flèche), et non pas différente de celle de la lentille d'hôte de la dorsale de l'iris (la flèche).
Figure 1. a) dorsale de l'iris des cellules épithéliales pigmentées cultivés in vitro pendant une période de 2 semaines. b) ventrale de l'iris des cellules épithéliales pigmentées cultivés in vitro pendant une période de 2 semaines. Notez que la pigmentation persiste à ce stade dans les cellules de l'iris à la fois dorsale et ventrale.
Figure 2. La capacité de régénération des cellules cultivées de l'IPE. induction du cristallin a) à partir agrégat de cellules dorsales IPE (flèche). Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche), di: dorsale de l'iris, vi: ventrale de l'iris, le: épithélium lentille LF: fibres optique. b) absence d'induction du cristallin agrégat de cellules ventrales IPE (flèche). Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche).
Figure 3. L'induction de l'objectif dans agrégées ventrale transfectées avec six-3 et traitée à l'acide rétinoïque. Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche). L'induction de l'objectif dans agrégées ventrale (flèche).
Discussion
Ce protocole a établi un système in vitro pour étudier les mécanismes de régénération lentille tritons. Depuis les agrégats (soit dorsale ou ventrale suivre fidèlement leur comportement in vivo lors de la régénération de cette technique peut atténuer l'énorme effort requis pour la transgénèse chez les tritons et peut être utilisé pour un gain de fonction ainsi que la perte de 7,8,9 expériences de fonction. Aussi , les agrégats ou les iris dans son ensemble peut être facilement traitée avec des facteurs de croissance et d'examiner leurs effets tels que décrits dans le présent protocole. Par exemple le rôle de la voie BMP a été étudié en utilisant cette technique 6.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention du NIH Ey10540 PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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