Summary
Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.
Abstract
Type 1 diabetes (T1D) is een T-cel gemedieerde auto-immuunziekte. Tijdens de pathogenese, de patiënten worden steeds meer insulinopenic zoals insuline productie verloren is gegaan, vermoedelijk dit voortvloeit uit de vernietiging van pancreatische beta-cellen door T-cellen. Inzicht in de mechanismen van beta-celdood tijdens de ontwikkeling van T1D zal inzichten verschaffen om een effectieve behandeling voor deze ziekte te genereren. Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) assays van oudsher de gebruikte radionuclide Chroom 51 (51 Cr) om doelcellen label. Deze doelstellingen worden vervolgens blootgesteld aan effector cellen en het vrijkomen van 51 Cr van target cellen wordt gelezen als een indicatie van de lymfocyt-gemedieerde celdood. Remmers van celdood resulteren in een verminderde afgifte van 51 Cr.
Als effector cellen, gebruikten we een geactiveerde autoreactieve clonale populatie van CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) geïsoleerd van een muis voorraad transgene voor zowel de alfa-en bèta-ketens van de AI4 T-cel receptor (TCR). Geactiveerde T-cellen AI4 werden samen gekweekt met 51 Cr gelabelde doelwit NIT cellen voor 16 uur, vrijlating van 51 Cr werd opgenomen om specifieke lysis te berekenen
Mitochondriën deel te nemen aan vele belangrijke fysiologische gebeurtenissen, zoals de productie van energie, de regulatie van signalering transductie, en apoptose. De studie van de beta cel mitochondriale functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van T1D is een nieuw gebied van onderzoek. Met behulp van de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) en confocale microscopische live cell imaging, we gecontroleerd mitochondriale membraanpotentiaal loop van de tijd in de beta-cellijn NIT-1. Voor beeldvorming studies werden effector AI4 T-cellen gelabeld met de fluorescente kleurstof Picogreen nucleaire kleuring. NIT-1-cellen en T cellen werden gekweekt in co-chambered dekglaasje en gemonteerd op de microscoop podium uitgerust met een live-cell kamer, gecontroleerd bij 37 ° C, met 5% CO 2, en bevochtigd. Tijdens deze experimenten foto's werden genomen van elke cluster om de 3 minuten voor 400 minuten.
Meer dan een cursus van 400 minuten, zagen we de afvoer van mitochondriale membraanpotentiaal in de NIT-1 cel clusters waar AI4 T-cellen werden bevestigd. In de gelijktijdige controle-experiment waar NIT-1-cellen werden samen gekweekt met MHC verkeerd afgestemd menselijke lymfocyten Jurkat cellen, mitochondriale membraanpotentiaal intact gebleven. Deze techniek kan worden gebruikt om real-time veranderingen in de mitochondriale membraanpotentiaal in cellen onder aanval van cytotoxische lymfocyten, cytokines, of andere cytotoxische reagentia te observeren.
Protocol
1. De voorbereiding van de cellen
- Doelcel cultuur: Cultuur van de muis beta-cellijnen, NIT-1 en NIT-4, werd een eerder beschreven 1,2 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0,02% BSA, niet-essentieel aminozuur, 15MM HEPES, 16,5 mm Glocose en penicilline / streptomycine. Voor 51 Cr etikettering, zaad cellen in een vlakke bodem 96-well plaat cultuur op 5x10 4 cellen / putje in 200 ul kweekmedium. Voor microscopie experimenten, zaad cellen in een acht-goed Lab-Tak II chambered dekglaasje op 5x10 4 per kamer in 500 ul kweekmedium, en laat vooraf laten groeien gedurende 48 uur voor het gebruik in de cytotoxiciteit experimenten.
- Controle T-cellijn cultuur: Gebruik de Jurkat cellijn (ATCC, CD3 + menselijke lymfocyt cellijn) als een negatieve controle. Cultuur Jurkat cellen in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat.
2. Inzameling en activering van effector autoreactieve CD8 + T-cellen
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] en NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] werden gekocht bij The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en gefokt in onze muis faciliteit. F1 hybride nakomelingen van kruisingen van de NOD-AI4a met NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] de ontwikkeling van diabetes op 3-5 weken oud zijn. Alle muizen werden gehuisvest in specifieke pathogeen-vrij faciliteiten en goedgekeurd door de desbetreffende instelling Animal Care en gebruik Comite.
- Euthanaseren van 3-4 weken oud NOD-AI4a / b muizen met behulp van CO 2.
- Verzamel milt van muizen. Gedood muizen zijn bereid met ethanol spray en geopend onder de chirurgische kap. Milt is verwijderd en in de ijskoude HBSS buffer onmiddellijk.
- Verzamel milt cellen met behulp van een 7 ml glas homogenisator. Twee tot drie milt elk worden in 5 ml koud HBSS en gehomogeniseerd met een 7 ml glas homogenisator. Homogenaat wordt verzameld en gecentrifugeerd bij 1200 gedurende 5 minuten bij 4 ° C met behulp van een Sorvall RT7 + centrifuge. Celpellets worden verzameld.
- Verwijder de rode bloedcellen met behulp van hypotone oplossing behandeling. Pellets worden behandeld met 5 ml hypotone oplossing / milt op ijs gedurende 5 minuten, vervolgens geneutraliseerd door het toevoegen van een gelijk volume van HBSS. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, en resuspendeer in 50 ml HBSS. Passeren de geschorste cellen door cellen zeef en te tellen met behulp van een hemocytometer met TrypanBlue vlekken.
- Activeren cellen. Resuspendeer cellen bij 5x10 6 / mL en te activeren met behulp van een 3-daagse cultuur met 0,1 uM AI4 mimotope (aminozuursequentie YFIENYLEL) en 25 U / ml IL-2 in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat.
3. 51 Cr los test om te onderzoeken CML
- Label doelcellen: Voeg 51 Cr aan cellen op een doel uCi / goed en cultuur voor 3 uur, en 3 keer wassen met kweekmedium.
- Suspend effector-cellen in RPMI 1640-medium, zoals vermeld in stap 2.5, zodat het uiteindelijke volume aan elk putje toegevoegd is 200 pi.
- Na de laatste wasbeurt van gemerkte doelcellen, voeg geactiveerde effector-cellen om het doel celculturen op de gewenste effector naar (E: T) doel ratio's. We meestal gebruik van E: T ratio op 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 en 50:1.
- Voeg verse gewijzigd RPMI 1640 medium (zie stap 2.5) tot 6 wells van target-cellen op te treden als een spontane lysis controle.
- Co-cultuur effector en doelcellen gedurende 16 uur.
- Verzamel supernatant in 6x50 mm Lime glazen buizen
- Lyse cellen door het toevoegen van 100μl 2% SDS en pipetteren een paar keer zachtjes.
- Verzamel cellysaat in een andere set van 6x50 mm Lime glazen buisjes.
- Een keer wassen putten met schone H 2 O en voeg de was naar de cel lysaat buizen.
- Tel de supernatants samen en cellysaten met behulp van een gamma-teller.
- Bereken specifieke lysis als volgt:
4. Kleuring van cellen voor live cell imaging
Onder de meest gebruikte mitochondriale membraanpotentiaal kleurstoffen, TMRM de minst mitochondriale toxiciteit vertoont. 3 Daarom kiezen we TMRM voor deze live-cell imaging studies.
- Bereid een 40 mM voorraad TMRM oplossing in DMSO en bewaar bij -20 ° C. Maak een [25 nM] verse werkende oplossing in fenol rood-vrij DMEM met alle supplementen voor NIT-een celcultuur 1.
- Vlek doel NIT-1-cellen met TMRM 25 nM gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Vervang de media met verse media met 5 nM TMRM het evenwicht verdeling van de kleurstof 4 te houden.
- Count geactiveerde effector AI4 T-cellen met behulp van een hematocytometer.
- Vlek geactiveerde effector AI4 T-cellen met een ul / ml Picogreen voor5 minuten bij kamertemperatuur en wassen met fenol rood-vrij kweekmedium 3 keer.
5. Het beoordelen van T-lymfocyt-gemedieerde beta celdood met behulp van live-cell imaging
- Monteer de chambered dekglaasje met glas NIT-cellen op het podium van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop. Verwijder het stickertje met een dremmel en gas de chambered glas steriliseren met Etheline oxide. Het podium is voorzien van een live-cell imaging kamer die de temperatuur geregeld op 37 ° C en 5% CO 2 met vocht. Heeft
- Voeg geactiveerd en gekleurd T-cellen bij de aangewezen kamers op verschillende E: T ratio.
- Toegevoegd hetzelfde aantal gekleurde Jurkat-cellen aan de controle kamers.
6. Het verkrijgen van live-cell beelden
De microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde fase die liet ons toe om steeds beelden te verwerven op verschillende locaties van dezelfde of verschillende kamers automatisch over het tijdsverloop van het experiment.
- Met behulp van een 63x olie objectief, foto's maken met een interval van elke 3 minuten voor een totaal van 300 frames per locatie.
- Detecteren TMRM kleuring met behulp van een excitatie golflengte van 543 nm en filterset voor emissie 565 tot 619 nm
- Detecteren Picogreen kleuring met behulp van een excitatie 488 nm en een filter instellen voor emissie 500 tot 630 nm. De video werd gemaakt met behulp van Zeiss LSM-software.
7. Video conversie voor publicatie
- Met behulp van de LSM Zeiss-software, maakt u een niet-gecomprimeerd filmbestand in een AVI-formaat.
- Om te zetten van de video in de gepubliceerde formaat, importeert u de video in het software pakket Fiji ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), een ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) de distributie, het gebruik van de Bioformats plugin van LOCI ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Pas de helderheid en contrast instellingen om de groene en rode signalen en de framerate was ingesteld op 2 frames / seconde met behulp van de animatie-opties menu balans.
- Snijd de video om 512 x 512 pixels en exporteren als een ongecomprimeerd AVI bestand.
- Open dit AVI-bestand in de software Quicktime 7 (Apple computer, Cupertino, CA) en comprimeren en exporteren in de open video-bestandsformaat H264/MPEG-4 1200 kbs / seconde.
8. Representatieve resultaten:
- Een vertegenwoordiger resultaat van 51 Cr CML-test. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een CML-test, waar procent specifieke lysis (Y-as), neemt toe naarmate de Effector: Target ratio (X-as) toeneemt. Doelcellen zijn primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiënte NOD Rag1-/ -. Muizen en voorzien van 51 Cr. Splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen zijn geïsoleerd en geactiveerd, zoals beschreven in stap 2 hierboven. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Percentage specifieke lysis wordt berekend als beschreven in stap 3.11.
- Twee representatieve (positieve en negatieve) resultaten van een T-cel-gemedieerde beta cel mitochondriale membraanpotentiaal dissipatie worden gepresenteerd. Cellen worden gekleurd en de reacties zijn opgenomen zoals beschreven in stap 4, 5 en 6 hierboven, video-bestanden worden gemaakt zoals in stap 7. Video 1: De muis beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerd, autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen op een E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal geleidelijk aan verdwenen tijdens een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met AI4 T-cellen. Video 2: Als een controle-experiment, NIT-1-cellen werden gekleurd met TMRM en co-gekweekt met Picogreen gekleurde Jurkat cellen op een E: T-verhouding van 50:1. Jurkat-cellen zijn een humane T-cel lijn die is MHC verkeerde. NIT-1-cellen aangehouden mitochondriale membraanpotentiaal gedurende de gehele duur van de 400 minuten co-incubatie periode. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus, niet laten doden.
Figuur 1 vertegenwoordiger gevolg van CML gebruiken als doelcellen primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiëntie NOD.Rag1-/ -. Muizen en splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Procent specifieke lysis neemt toe naarmate de Effector: Target-ratio toeneemt.
Video 1. Mouse beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerde autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen bij E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal dissipated geleidelijk in een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met groene AI4 T-cellen. Klik hier om video te bekijken .
Video 2. NIT-1-cellen werden dezelfde gekleurd zoals beschreven in de Video 1 en co-gekweekt met Picogreen gebrandschilderde humane T-cellijn Jurkat. NIT-1-cellen waren in staat om mitochondriale membraanpotentiaal doordacht de duur van 400 minuten te houden. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus niet het braken doden. Klik hier om de video te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytotoxische T-cel gemedieerde beta celdood is de belangrijkste pathofysiologie van T1D 5. CML testen met behulp van 51 Cr vrijgeven ons toelaten om de graad van effector-target response 6 studiepunten. Echter, de gedetailleerde proces en de paden van T-cel-gemedieerde celdood beta nog steeds niet volledig begrepen. Omdat mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bèta-celfunctie en dood 7, richtten we ons op de mitochondriale veranderingen tijdens de visuele CML. Mitochondriale membraanpotentiaal dissipatie is een vroege en onomkeerbare stap tijdens de mitochondriale functionele veranderingen die leiden tot apoptose 8. Met behulp van confocale microscopie live cell imaging, konden we beta cel mitochondriale membraanpotentiaal dissipatie visualiseren tijdens interacties met autoreactieve T-lymfocyten. Deze experimentele setting bootst ten minste een deel van wat er gebeurt met beta-cellen tijdens de ontwikkeling van T1D. Beperkingen van dit experiment zijn onder meer: de verwarming inzetstuk voor live-cell imaging uitgerust met onze Zeiss microscoop is ontworpen voor 3,5 cm petrischalen, daarom bij gebruik van 8-well Lab-Tak II chambered dekglaasje (voor het gelijktijdig opnemen van behandeld en controles), het handvat op de chambered dekglaasje moet worden verwijderd om te passen in de microscoop te voegen. Ook omdat de verwarming insert is ontworpen voor een 35mm petrischaal, wanneer we 8-goed Lab-Tak II chambered dekglaasje, waren we beperkt tot het centrum vier putten. Deze beperking kan gemakkelijk worden opgelost door de installatie van een verwarmings-insert speciaal ontworpen voor Lab-Tak II chambered dekglaasje door Zeiss. Eventuele wijzigingen van dit experiment met inbegrip van het gebruik van genetisch fluorescerende effector T-cellen te richten cellen aan te vallen, of het testen signaalwegen van cytokines of cel-cel interacties. Beta-celdood in de pathogenese van T1D is een gecompliceerd proces, bestaat uit meerdere paden met inbegrip van maar niet beperkt tot, Granzym en perforine 9, Fas / Fas ligand 9, cytokinen 10. Er zijn fluorescerende substraten voor caspases en granzyme B in de handel verkrijgbaar: met deze keuzes is het mogelijk om te studeren wegen en de volgorde van de gebeurtenissen tijdens de beta-celdood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK074656 en AI56374 (CEM), evenals de Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
