Summary
Клеточный lymphocytotoxicity (ХМЛ), анализы могут быть использованы для тестирования аутореактивных ответы и изучение механизмов смерти клеток в пробирке. Тем не менее, с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии изображений с флуоресцентными красителями, типа и кинетики гибели клеток, а также путей использованы может быть изучен более детально.
Protocol
1. Подготовка клетки
- Культуры клеток-мишеней: Культура мыши бета клеточных линий, NIT-1 и NIT-4, было описано выше 1,2 в DMEM с добавлением 10% FBS, 0,02% BSA, Номера для незаменимая аминокислота, 15 мм HEPES, 16.5мм Glocose и пенициллина / стрептомицина. Для 51 Cr маркировки, семенами клеток в плоскодонных 96-луночного планшета для культуры в 5х10 4 клеток / лунку в 200 мкл культуральной среды. Для микроскопии экспериментов, семенные клетки в 8-а-Так Лаборатории II патрон 5x10 покровного стекла на 4 на камеру в 500 мкл культуральной среде, и позволяют выращивать в течение 48 часов до использования в цитотоксичности экспериментов.
- Управление Т-клеток линии культуры: Используйте Jurkat клеточной линии (АТСС, CD3 + лимфоцитов человека клеточной линии) в качестве отрицательного контроля. Культуры клеток в Jurkat RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.
2. Сбор и активации эффекторных аутореактивных CD8 + Т-клеток
NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] и NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] были приобретены у лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME) и разводят в нашей мыши объекта. F1 гибридное потомство от вязки из NOD-AI4a с NOD-AI4b [NOD-AI4a / B] развития диабета в 3-5 недель. Все мыши были размещены в конкретный возбудитель, свободных средств и утверждается животных соответствующие учреждения по уходу и использованию комитета.
- Эвтаназии 3-4 недельных NOD-AI4a / б мышей использованием CO 2.
- Сбор селезенки от мышей. Эвтаназии мышей готовы с этанолом брызг и возбуждено по хирургической капотом. Селезенки удаляются и положить в ледяной буфером HBSS немедленно.
- Сбор клеток селезенки использованием 7 мл стеклянного гомогенизатора. Два-три селезенки каждого ставятся в 5 мл холодной HBSS и гомогенизировали с 7 мл стеклянного гомогенизатора. Гомогенат собирают и центрифугируют при 1200rpm в течение 5 минут при температуре 4 ° С с использованием Sorvall RT7 + центрифуги. Сотовые гранулы собираются.
- Удаление эффекта красных клетках крови с использованием гипотоническая обработка раствором. Пеллеты относятся с 5 мл гипотонического раствора / селезенки на льду в течение 5 минут, затем нейтрализуют добавлением равного объема HBSS. Сбор клетки центрифугированием, как описано выше, и ресуспендируют в 50 мл HBSS. Pass приостановлено клетки через клеточные сито и считать использование гемоцитометра с окрашиванием TrypanBlue.
- Активация клеток. Ресуспендируют клеток 5х10 6 / мл и активации с использованием 3-х дневный культуры с 0,1 мкМ AI4 mimotope (амино YFIENYLEL последовательность кислота) и 25 ед / мл ИЛ-2 в RPMI1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1,5 г / L бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия.
3. 51 Cr релиз анализа для изучения CML
- Этикетка клетки цель: добавить 51 Cr с клетками-мишенями на 1 мкКи / лунку и культуры в течение 3 часов, и промыть 3 раза культуральной среде.
- Приостановить эффекторных клеток в RPMI 1640, как указано в шаге 2,5, так что конечный объем в каждую лунку добавляют 200 мкл.
- После последней промывки меченых клеток-мишеней, добавляют активированный эффекторные клетки к клетке-мишени культур на желаемом эффекторных до цели (E: T) коэффициентов. Мы обычно используем E: T отношений на 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 и 50:1.
- Добавьте свежие изменение RPMI 1640 среде (см. шаг 2.5) до 6 скважин клеток-мишеней в качестве спонтанного лизиса контроль.
- Сотрудничество культуры эффекторов и клеток-мишеней в течение 16 часов.
- Сбор супернатант в 6x50 мм Известь стеклянные трубки
- Lyse клетки путем добавления 100 мкл 2% SDS и пипетки несколько раз мягко.
- Сбор Клеточный лизат в другой набор 6x50 мм Известь стеклянные трубки.
- Вымойте скважин раз с чистой H 2 O и добавить мыть в трубах Клеточный лизат.
- Граф супернатанты и клеточных лизатов с помощью гамма-счетчика.
- Рассчитать конкретных лизис следующим образом:
4. Окрашивание клеток для живого изображения ячейки
Среди наиболее часто используемых митохондриального мембранного потенциала красители, TMRM экспонатов мере митохондриальной токсичности. 3 Таким образом, мы выбираем TMRM для этих исследований жить изображений клеток.
- Подготовка 40 мМ фондовом TMRM раствора в ДМСО и хранить при температуре -20 ° C. Сделать [25 нм] свежие рабочего раствора в фенол красный без DMEM со всеми дополнениями для NIT-1 клеточная культура 1.
- Пятно целевой NIT-1 клеток с TMRM 25 нм в течение 30 мин при 37 ° C.
- Замените СМИ со свежей средой, содержащей 5 нМ TMRM для поддержания равновесного распределения красителя 4.
- Граф активированный эффекторные Т-клетки AI4 использованием гемоцитометр.
- Пятно активированный эффекторных AI4 Т-клеток с 1 мкл / мл для Picogreen5 минут при комнатной температуре и мыть с фенолом красным без питательной среды в 3 раза.
5. Оценка Т-лимфоцитов-опосредованных бета гибели клеток с использованием живого изображения ячейки
- Горы покровного стекла патрон с окрашенных клеток NIT на сцене Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Удалить вкладку с dremmel и газовой стерилизации стеклянных патрон с оксидом etheline. Этап оснащен жить-клеточной изображений камера, которая с контролем температуры на 37 ° С и 5% CO 2 с влагой.
- Добавить активируется и окрашенных Т-клеток, назначенных камер при разных E: T отношений.
- Добавлен же количество окрашенных клеток Jurkat с контролем камер.
6. Получение изображения в реальном времени клетка
Микроскоп снабжен моторизованным этапе, что позволило нам неоднократно получать изображения в разных местах, от одного или разных камер автоматически за время хода эксперимента.
- Использование 63x объектив нефти, получать изображения с интервалом в каждые 3 минуты в общей сложности 300 кадров в месте.
- Обнаружение TMRM окрашивания использованием длины волны возбуждения 543 нм и набор фильтров для излучения 565-619 нм
- Обнаружение Picogreen окрашивания использованием возбуждении 488 нм и набор фильтров для излучения 500-630 нм. Видео было создано с помощью Zeiss LSM программного обеспечения.
7. Конвертация видео для публикации
- Использование программного обеспечения Zeiss LSM, создавать несжатый файл фильма в формате AVI.
- Для преобразования видео в формат опубликованы, импорта видео в пакет программного обеспечения Фиджи ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ц / ) распределения, используя Bioformats плагин из локусов ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Регулировка яркости и контрастности, чтобы сбалансировать зеленый и красный сигналы и частота кадров была установлена на 2 кадр / сек, используя меню анимации вариантов.
- Crop видео до 512 х 512 пикселей и экспорта, как несжатый файл AVI.
- Откройте этот файл AVI в Программное обеспечение QuickTime 7 (Apple Computer, Купертино, Калифорния), а также сжатие и экспорта в открытый формат файлов видео H264/MPEG-4 при 1200 кбит / сек.
8. Представитель Результаты:
- Представитель результате анализа 51 Cr ХМЛ. На рисунке 1 показана представитель результате анализа ХМЛ, где процент конкретных лизис (Y ось) увеличивается по мере создания эффектов: Целевые отношения (оси Х) возрастает. Целевые клетки островков первичной изолированной от иммунодефицитных NOD RAG1-/ -. Мышей и помечен 51 Cr. Спленоциты от NOD.AI4α / β трансгенных мышей изолированы и активированные как описано в шаге 2 выше. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис рассчитывается как описано в шаге 3,11 выше.
- Два представителя (положительные и отрицательные) результаты Т клеточного бета-клеток митохондриального мембранного потенциала диссипации представлены. Клетки окрашивали и реакции регистрируются как описано в пунктах 4, 5 и 6 выше, видео-файлы создаются как в шаге 7. Видео 1: клетка мыши бета линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный, аутореактивных CD8 + Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала рассеивается постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с AI4 Т-клеток. Видео 2: В качестве контрольного эксперимента, NIT-1 клетки окрашивали TMRM и совместно с культурно Picogreen окрашенных клеток Jurkat на E: T отношением 50:1. Jurkat клетки человеческого Т-клеточной линии, МНС неверными. NIT-1 клеток поддерживается митохондриального мембранного потенциала на всем протяжении от 400 минут со-инкубационный период. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства.
Рисунок 1 представитель результате ХМЛ, используя в качестве клеток-мишеней первичных островков изолированы от иммунодефицитных NOD.Rag1-/ -. Мышей и спленоцитов от NOD.AI4α / β трансгенных мышей. Цели и эффекторы были совместно культивировали в течение 16 часов. Процент конкретных лизис возрастает по мере создания эффектов: увеличение целевой отношение.
Видео 1. Мышь бета-клеточной линии NIT-1 была запятнана митохондриального мембранного потенциала красителя TMRM (красный). Активированный аутореактивных CD8 + Т-клеток AI4 (Витраж зеленый с Picogreen) были инициаторами культивировали с этим NIT-1 клетки на E: T отношением 50:1. NIT-1 митохондриального мембранного потенциала диссипацииТед постепенно в течение 400 минут длительности, но только в кластеры, которые взаимодействуют с зелеными AI4 Т-клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .
Видео 2. NIT-1 клетки окрашивали же, как описано в Video 1 и со-культивировали с Picogreen окрашенных человека Jurkat клеточной линии T. NIT-1 клетки в состоянии поддерживать митохондриальный мембранный потенциал продуманы продолжительностью 400 минут. Jurkat клетки не взаимодействует с NIT-1 кластеров и, следовательно, не вызывают убийства. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цитотоксических Т-клеток опосредованной смерти бета-клеток является основным патофизиологии T1D 5. CML анализов использованием 51 Cr релизе позволяют исследовать степень эффекторных-целевой отклик 6. Тем не менее, детальный процесс и пути Т клеточного гибели клеток бета-прежнему полностью не поняты. Так как митохондрии имеют решающее значение для бета-функции клеток и смерти 7, мы сосредоточились на митохондриальные изменения во время визуального ХМЛ. Митохондриальная мембранного потенциала диссипации рано и необратимый шаг в митохондриальной функциональных изменений, приводящих к апоптозу 8. Использование конфокальной микроскопии живых изображений клетки, мы были в состоянии представить себе бета-клеток митохондриальной диссипацию мембранного потенциала при взаимодействии с аутореактивных Т-лимфоцитов. Эта экспериментальная установка имитирует хотя бы часть того, что случается с бета-клеток в процессе развития СД1. Ограничения этого эксперимента являются: нагревание вставки для живого изображения ячейки оснащены нашими Zeiss микроскоп был разработан для 3,5 см чашках Петри, поэтому при использовании 8-а-Так Лаборатории II патрон покровного стекла (для одновременной записи обработанных и контроля), ручка на покровного стекла патрон должен быть удален, чтобы вписаться в микроскоп вставки. Кроме того, поскольку нагревание вставки предназначен для 35-мм блюдо Петри, когда мы используем 8-а-Так Лаборатории II патрон покровного стекла, мы были ограничены центр 4 скважины. Это ограничение может быть легко решена путем установки отопления вставить специально разработан для лаборатории-Tak II патрон покровного стекла от Zeiss. Возможные изменения этого эксперимента в том числе с использованием генетически флуоресцентные эффекторные Т-клетки атаковать клетки-мишени, или тестирование сигнальных путей цитокинов и межклеточных взаимодействий. Бета гибель клеток в патогенезе T1D представляет собой сложный процесс, включает в себя несколько путей, включая, но не ограничиваясь, гранзима и перфорина 9, Fas / Fas лиганд 9, цитокинов 10. Есть флуоресцентных субстратов каспаз и гранзима B имеются в продаже, с этим выбором можно изучать пути и последовательность событий, в ходе бета-клеточной смерти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университета Флориды Институциональные уходу и использованию животных комитета.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и DK074656 AI56374 (CEM), а также несовершеннолетних исследовательского фонда диабета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
