Клеточный lymphocytotoxicity (ХМЛ), анализы могут быть использованы для тестирования аутореактивных ответы и изучение механизмов смерти клеток в пробирке. Тем не менее, с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии изображений с флуоресцентными красителями, типа и кинетики гибели клеток, а также путей использованы может быть изучен более детально.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сахарный диабет 1 типа (СД1) представляет собой аутоиммунное заболевание, опосредованное Т-клетками. В ходе патогенеза у пациентов прогрессирует инсулинопения из-за прекращения выработки инсулина, что, предположительно, является результатом разрушения бета-клеток поджелудочной железы Т-клетками. Понимание механизмов гибели бета-клеток при развитии СД1 позволит найти способы создания эффективного метода лечения этого заболевания. В анализах клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности (КОЛ) исторически использовали радионуклид хром-51 (51Cr) для маркировки клеток-мишеней. Затем эти мишени подвергают воздействию эффекторных клеток, и высвобождение 51Cr из клеток-мишеней регистрируют как показатель гибели клеток, опосредованной лимфоцитами. Ингибиторы гибели клеток приводят к снижению высвобождения 51Cr.
В качестве эффекторных клеток мы использовали активированную аутореактивную клональную популяцию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), выделенных из линии трансгенных мышей по обеим цепям (альфа и бета) Т-клеточного рецептора (TCR) AI4. Активированные Т-клетки AI4 культивировали совместно с таргетными клетками NIT, меченными 51Cr, в течение 16 часов, после чего регистрировали выход 51Cr для расчета специфического лизиса
Митохондрии участвуют во многих важных физиологических процессах, таких как выработка энергии, регуляция сигнальной трансдукции и апоптоз. Изучение функциональных изменений митохондрий бета-клеток при развитии СД1 является новым направлением исследований. Используя краситель для определения потенциала митохондриальной мембраны тетраметилродаминметиловый эфир (TMRM) и конфокальную микроскопию живых клеток, мы наблюдали за изменением потенциала митохондриальной мембраны с течением времени в линии бета-клеток NIT-1. Для проведения визуализационных исследований эффекторные T-клетки AI4 были помечены флуоресцентным красителем для ядер Picogreen. Клетки NIT-1 и T-клетки культивировали совместно в камерах на покровных стеклах, которые затем устанавливали на предметный столик микроскопа, оснащенного камерой для живых клеток с контролируемой температурой 37°C, содержанием CO2 5% и увлажнением. В ходе этих экспериментов снимки каждого кластера делались каждые 3 минуты в течение 400 минут.
В течение 400 минут мы наблюдали снижение митохондриального мембранного потенциала в кластерах клеток NIT-1, к которым были прикреплены T-клетки AI4. В параллельном контрольном эксперименте, где клетки NIT-1 культивировались совместно с человеческими лимфоцитами Jurkat с несовместимым MHC, митохондриальный мембранный потенциал оставался неизменным. Данный метод может быть использован для наблюдения в режиме реального времени за изменениями митохондриального мембранного потенциала в клетках, подвергающихся воздействию цитотоксических лимфоцитов, цитокинов или других цитотоксических реагентов.
Протокол
1. Подготовка клетки
- Культуры клеток-мишеней: Культура мыши бета клеточных линий, NIT-1 и NIT-4, было описано выше 1,2 в DMEM с добавлением 10% FBS, 0,02% BSA, Номера для незаменимая аминокислота, 15 мм HEPES, 16.5мм Glocose и пенициллина / стрептомицина. Для 51 Cr маркировки, семенами клеток в плоскодонных 96-луночного планшета для культуры в 5х10 4 клеток / лунку в 200 мкл культуральной среды. Для микроскопии экспериментов, семенные клетки в 8-а-Так Лаборатории II патрон 5x10 покровного стекла на 4 на камеру в 500 мкл культуральной среде, и позволяют выращивать в течение 48 часов до использования в цитотоксично....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цитотоксических Т-клеток опосредованной смерти бета-клеток является основным патофизиологии T1D 5. CML анализов использованием 51 Cr релизе позволяют исследовать степень эффекторных-целевой отклик 6. Тем не менее, детальный процесс и пути Т клеточного гибели клеток бета-прежнему полностью не поняты. Так как митохондрии имеют решающее значение для бета-функции клеток и смерти 7, мы сосредоточились на митохондриальные изменения во время визуального ХМЛ. Митохондриальная мембранн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университета Флориды Институциональные уходу и использованию животных комитета.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и DK074656 AI56374 (CEM), а также несовершеннолетних исследовательского фонда диабета.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| Cr-51 | Перкин Элмер | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl родамина метиловый эфир (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | аминокислотной последовательности: YFIENYLEL | |
| Ил-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Бычьего сывороточного альбумина | Сигма | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Номера для незаменимых аминокислот | GIBCO | 11140 | |
| Пенициллин / стрептомицин | Близнецы | 400-109 | |
| Фенол красный без DMEM | Сигма | D5303 | |
| СО2 инкубатор | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Хранится стерильный для культуры клеток |
| Биологические кабинета безопасности | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Одноразовые труб культуры, 6x50 мм Известь стекла | Рыболов | 14-958- | |
| Радиоактивность | Перкин Элмер | Мастер 1470 Автоматическая радиоактивность | |
| Конфокальной микроскопии | Zeiss | LSM 510 Мета конфокальной | С моторизованных этапе и жить камере ячейки |
| Пипетка (1 мл, 200 мкл, 20 мкл, 10 мкл, 2μl) | Эппендорф | ||
| Трубы (янтарный) | Рыболов | 50819772 | |
| Центрифуга | Sorvall Легенда RT + | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Вертикальный микроскоп | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Мыши | Лаборатории Джексона | 004347 | |
| NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Мыши | Лаборатории Джексона | 004348 | |
| NOD-AI4α / β F1 мышей | N / A | N / A | Выведен в объект животного UF |
Ссылки
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
