Summary
Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.
Abstract
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 (51 Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de 51 Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de 51 Cr.
Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con 51 Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de 51 Cr se registró para el cálculo de lisis específica
Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO 2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos.
Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.
Protocol
1. Preparación de las células
- Objetivo el cultivo de células: la cultura de las líneas celulares de ratón beta, NIT-1 y NIT-4, fue de 1,2 se ha descrito anteriormente en DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,02% de BSA, no de aminoácidos esenciales, 15 mM HEPES, 16,5 mm Glocose y penicilina / estreptomicina. El 51 Cr etiquetado, las células de las semillas en un fondo plano de 96 pocillos placa de cultivo de 5x10 4 células / pocillo en 200 l medio de cultivo. Para los experimentos de microscopía, las células de las semillas en un 8 y Lab-Tak cubreobjetos II de cámara en cámara de 5x10 4 por 500 en el medio de cultivo l, y dejar crecer durante 48 horas antes de usar en los experimentos de citotoxicidad.
- El control de las células T cultura línea: Utilice la línea celular Jurkat (ATCC, CD3 + línea celular humana de linfocitos) como control negativo. Cultivo de células Jurkat en RPMI1640 complementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio.
2. Recolección y la activación de efectores autorreactivos células T CD8 +
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] y NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] fueron adquiridos de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y criados en nuestras instalaciones de ratón. Progenie híbrida F1 de cruces de NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] desarrollar diabetes en 3-5 semanas de edad. Todos los ratones fueron alojados en libres de patógenos específicos y aprobados por las instalaciones de Cuidado de Animales de la institución en cuestión y el empleo.
- 3-4 semanas de edad, la eutanasia AI4a NOD-/ b ratones utilizando CO 2.
- Recoger el bazo de los ratones. Los ratones sacrificados se preparan con spray de etanol y se abrió bajo el capó quirúrgica. Bazos se quitan y se ponen en helado buffer HBSS inmediatamente.
- Recoger las células del bazo con un homogeneizador de vidrio de 7 ml. De dos a tres bazos cada uno se puso en 5 ml de HBSS frío y homogeneizados con un homogeneizador de 7 ml de vidrio. Homogeneizado se recoge y se centrifuga a 1200rpm durante 5 minutos a 4 ° C utilizando una centrifugadora Sorvall RT7 +. Gránulos de las células se recogen.
- Eliminar las células rojas de la sangre mediante un tratamiento con una solución hipotónica. Los pellets son tratados con 5 ml de solución hipotónica / bazo en hielo durante 5 minutos, luego se neutraliza mediante la adición de un volumen igual de HBSS. Recoger las células por centrifugación, como el anterior, y resuspender en 50 ml de HBSS. Pase la suspensión de células a través de células colador y contar con un hemocitómetro con tinción TrypanBlue.
- Activar las células. Resuspender las células en 5x10 6 / ml y activar mediante un cultivo de 3 días con 0,1 M AI4 mimotopo (YFIENYLEL secuencia de aminoácidos) y 25 U / mL de IL-2 en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio.
3. Ensayo de liberación de 51 Cr para examinar CML
- Células etiqueta de destino: Agregar 51 Cr a las células diana en un Ci / pocillo y la cultura durante 3 horas, y lavar 3 veces con medio de cultivo.
- Suspender las células efectoras en medio RPMI 1640 como se mencionó en el paso 2.5 para que el volumen final a cada pocillo es de 200 l.
- Después del último lavado de las células diana marcada, añada activar las células efectoras de las culturas de las células diana a efector deseado al objetivo (E: T) ratios. Por lo general, el uso E: T ratios de 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 50:1.
- Añadir nuevo modificado RPMI 1640 (véase el paso 2.5) a 6 pozos de las células diana para actuar como un control de lisis espontánea.
- Co-cultivo las células efectoras y diana durante 16 horas.
- Recoger el líquido sobrenadante en tubos de 6x50 mm de vidrio de cal
- Lisis de las células mediante la adición de 100μl 2% de SDS y pipetear varias veces con suavidad.
- Recoger lisado celular en otro juego de tubos de vidrio 6x50 mm de cal.
- Lavar una vez con la limpieza de pozos H 2 O y añadir el lavado de las trompas de lisado celular.
- Contar con los sobrenadantes y lisados de células utilizando un contador gamma.
- Calcular lisis específica de la siguiente manera:
4. Tinción de las células de imágenes de células vivas
Entre los más utilizados potencial de membrana mitocondrial colorantes, TMRM exhibe la menor toxicidad mitocondrial. 3 Por lo tanto, elegimos TMRM para estos estudios de imágenes de células vivas.
- Prepare una solución de 40 mM de TMRM en DMSO y almacenar a -20 ° C. Haga un [25 nM] solución de trabajo fresca en rojo fenol libre de DMEM con todos los suplementos de NIT-1 cultivo celular 1.
- Mancha objetivo NIT-1 con células TMRM 25 nM durante 30 minutos a 37 ° C.
- Vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de comunicación fresco que contiene 5 nM TMRM para mantener el equilibrio de distribución del colorante 4.
- Conde activa las células T efectoras AI4 utilizando un hematocitómetro.
- Mancha activa las células T efectoras AI4 con 1 l / mL para Picogreen5 minutos a temperatura ambiente y lavar con rojo fenol libre de medio de cultivo 3 veces.
5. La evaluación de los linfocitos T mediada por la muerte de las células beta usando imágenes de células vivas
- Monte la cámara cubre objetos con células NIT manchado en el escenario de un Zeiss LSM 510 microscopio confocal. Retire la lengüeta con una dremmel y gas esterilizar el vidrio con óxido de cámaras Etheline. El escenario está equipado con una cámara de imágenes de células vivas, que tiene la temperatura controlada a 37 ° C y 5% de CO 2 con la humedad.
- Añadir activa y se tiñeron las células T a las cámaras designadas en diferentes E: T ratios.
- Añadido el mismo número de células Jurkat manchado a las cámaras de control.
6. La obtención de imágenes de células vivas
El microscopio está equipado con una platina motorizada que nos permite adquirir imágenes en repetidas ocasiones en diferentes lugares de las cámaras de iguales o diferentes de forma automática en el transcurso del experimento.
- El uso de un lente de 63x de aceite objetivo, capturar imágenes a intervalos de cada 3 minutos para un total de 300 cuadros por ubicación.
- Detectar manchas TMRM con una longitud de onda de excitación de 543 nm y el conjunto de filtros para la emisión de 565-619 nm
- Detectar manchas Picogreen con una excitación de 488 nm y un conjunto de filtros para la emisión de 500-630 nm. El video fue creado usando el software Zeiss LSM.
7. De conversión de vídeo para su publicación
- Usando el software LSM Zeiss, crear un archivo de película sin comprimir en formato AVI.
- Para convertir el vídeo en el formato de publicación, importar el vídeo en el paquete de software FIJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), un ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) la distribución, usando el plugin Bioformats de loci ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Ajustar la configuración del brillo y el contraste para equilibrar las señales de color verde y rojo y la velocidad de fotogramas se establece en 2 fotogramas / segundo utilizando el menú de opciones de animación.
- Recortar el vídeo a 512 x 512 píxeles y la exportación como un archivo AVI sin comprimir.
- Abrir el archivo AVI en el software Quicktime 7 (ordenador de Apple, Cupertino, CA) y comprimir y exportar en el formato de archivo de vídeo abierto H264/MPEG-4 a 1200 kbs / segundo.
8. Los resultados representativos:
- Un resultado representativo de 51 Cr ensayo de LMC. La figura 1 muestra un resultado representativo de un ensayo de LMC en la lisis por ciento específica (eje Y) aumenta a medida que el efector: relación de destino (eje X) se incrementa. Las células diana son islotes aislados de primaria inmunodeficientes NOD Rag1-/ -. Ratones y etiquetados con 51 Cr. Esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β son aislados y se activa como se describe en el paso 2. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis por ciento determinado se calcula como se describe en el paso por encima de 3,11.
- Dos representantes (positivo y negativo) los resultados de una mediada por células T disipación de las células beta del potencial de membrana mitocondrial se presentan. Las células se tiñen y las reacciones se registran como se describe en los pasos 4, 5 y 6, los archivos de vídeo se crean como en el paso 7. Video 1: La versión beta del ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial tinte TMRM (rojo). Activado, autorreactivos células T CD8 + AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 en las células en un E: T relación de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial se disipa poco a poco durante una duración de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4. Video 2: Como un experimento de control, NIT-1 células se tiñeron con TMRM y co-cultivadas con células Jurkat Picogreen manchada en un E: T relación de 50:1. Células Jurkat es un ser humano línea de células T que es MHC no coincidentes. NIT-1 células mantiene el potencial de membrana mitocondrial durante toda la duración de los 400 minutos de co-período de incubación. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto, no provocar el asesinato.
Figura 1 resultado Representante de la LMC utilizando como células isletas objetivo principal aislado de inmunodeficiencia NOD.Rag1-/ -. Ratones y esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis porcentaje específico aumenta a medida que la unidad de efectos: aumenta la proporción de destino.
Video 1. Beta ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial TMRM colorante (rojo). Activado autorreactivos células T CD8 + AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 células en E: T relación de 50:1. NIT-1 membrana mitocondrial potencial de disipaciónTed gradualmente durante un período de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4 verde. Haga clic aquí para ver el video .
Video 2. NIT-1 las células se tiñeron mismo que se describe en el video 1 y co-cultivadas con Picogreen manchada Jurkat línea de células T humanas. NIT-1 células fueron capaces de mantener el potencial de membrana mitocondrial pensado la duración de 400 minutos. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto no inducen muerte. Haga clic aquí para ver el video .
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Discussion
Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 5. Ensayos de CML con 51 Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo 6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de siete, nos hemos centrado en cambios en las mitocondrias durante el CML visual. Disipación del potencial de membrana mitocondrial es un primer paso e irreversibles en los cambios mitocondriales funcionales que llevan a la apoptosis 8. Utilizando imágenes de microscopía confocal de células vivas, que fueron capaces de visualizar las células beta mitocondrial disipación potencial de membrana durante la interacción con los linfocitos T autorreactivos. Esta configuración experimental imita al menos parte de lo que ocurre con las células beta durante el desarrollo de DT1. Las limitaciones de este experimento son: la inserción de calefacción para imágenes de células vivas equipado con nuestro microscopio Zeiss ha sido diseñado para 3,5 cm placas de Petri, por lo tanto, cuando se utiliza de 8 y Lab-Tak II cámaras cubre objetos (para la grabación simultánea de tratados y los controles), el mango en el cubre cámaras debe ser eliminado para que se ajuste en la inserción de microscopio. Además, debido a la inserción de calentamiento está diseñado para un plato de Petri de 35 mm, cuando el uso de 8 y Lab-Tak II cámaras cubre objetos, que se limita al centro de 4 pozos. Esta limitación puede ser fácilmente resuelto mediante la instalación de un inserto de calefacción diseñado específicamente para Lab-Tak cubreobjetos II cámaras de Zeiss. Posibles modificaciones de este experimento, usando células efectoras T fluorescentes genéticamente para atacar a las células diana, o pruebas de las vías de señalización de citoquinas o de interacciones célula-célula. Muerte de las células beta en la patogénesis de la DT1 es un proceso complicado, implica múltiples vías, incluyendo pero no limitado a, las citoquinas Granzime y perforina 9, Fas / Fas ligando 9, 10. Hay sustratos fluorescentes para las caspasas y B granzima disponibles en el mercado, con estas opciones es posible estudiar las vías y la secuencia de eventos durante la muerte de las células beta.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Florida Cuidado de Animales institucional y el empleo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y DK074656 AI56374 (CEM), así como la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
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