Summary
Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.
Abstract
Tip 1 diyabet (T1D) T hücre aracılı otoimmün hastalık. Patogenezinde sırasında, hastaların insülin üretimi kayıp olarak T hücreleri tarafından pankreas beta hücrelerinin yıkımını muhtemelen bu sonuç, giderek daha insulinopenic hale gelir. T1D gelişimi sırasında beta hücre ölüm mekanizmaları anlamak, bu hastalık için etkili bir çare üretmek için anlayışlar sağlayacaktır. Hücre aracılı lenfositotoksisite (KML) testlerin tarihsel hedef hücreleri etiket radyonüklid Krom 51 (51 Cr) kullanılır. Bu hedefler daha sonra efektör hücreleri maruz kalan ve 51 Cr hedef hücrelerden serbest bırakılması lenfosit aracılı hücre ölümü bir göstergesi olarak okunur . 51 Cr azalmış serbest hücre ölümü sonucu inhibitörleri.
Efektör hücreler olarak, CD8 aktive otoreaktif klonal nüfus + AI4 T hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri için bir fare stok transgenik izole Sitotoksik T lenfositler (CTL) kullanılır. Aktif AI4 T hücreleri 16 saat boyunca 51 Cr etiketli hedef NIT hücreleri birlikte kültür, serbest bırakılması 51 Cr belirli lizis hesaplamak için kaydedildi
Mitokondri, enerji üretimi, sinyal transdüksiyon düzenlenmesi ve apoptosis gibi birçok önemli fizyolojik olaylar, katılırlar. T1D gelişimi sırasında beta hücre mitokondrial fonksiyonel değişiklikler çalışma, bir araştırma roman alanıdır. Mitokondriyal membran potansiyeli boya tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) ve konfokal mikroskobik canlı hücre görüntüleme kullanarak, beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli zaman içinde izlenmektedir. Görüntüleme çalışmaları için, efektör AI4 T hücreleri floresan nükleer boyanma boya Picogreen etiketli. NIT-1 ve T hücreleri odacıklı coverglass ortak kültür ve canlı bir hücre odası ile donatılmış mikroskop aşamasında üzerine monte edilmiş, 37 kontrol edildi ° C,% 5 CO 2 ve nemlendirilmelidir. Bu deneyler sırasında görüntüleri her küme her 3 dakikada bir 400 dakika alındı.
400 dakika boyunca, biz AI4 T hücreleri bağlı NIT-1 hücre kümeleri mitokondrial membran potansiyeli dağılımı görülmektedir. NIT-1 hücreleri MHC ile birlikte kültüre edildi eşzamanlı kontrol deneyde yanlış uyumlu insan lenfosit Jurkat hücreleri, mitokondriyal membran potansiyeli bozulmadan kalabilmiş. Bu teknik, sitotoksik lenfosit, sitokinler, veya diğer sitotoksik reaktifler saldırı altında hücreleri mitokondrial membran potansiyeli gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir.
Protocol
1. Hücrelerin hazırlanması
- Hedef hücre kültürü: Kültür fare beta hücre hatları, NIT-1 ve NIT-4,% 10 FBS,% 0.02 BSA, Non-esansiyel amino asit, 15mm Hepes, 16.5mm ile desteklenmiş DMEM önceden açıklanan 1,2 oldu Glocose ve Penisilin / Streptomisin. 5x10 4 hücre düz bir alt 96-kuyu kültür plaka 51 Cr etiketleme, tohum hücreleri / 200 ul kültür ortamı iyi. Mikroskopi deneyler, 500 ul kültür ortamı oda başına 5x10 4 8-iyi Lab-Tak II odacıklı coverglass tohum hücreleri ve sitotoksisite deneyleri kullanarak 48 saat önce büyümek için izin.
- Kontrol T hücre hattı kültürü: (ATCC, CD3 + insan lenfosit hücre hattı) negatif kontrol olarak Jurkat hücre hattı kullanın. RPMI1640 Kültür Jurkat hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 2 mM L-glutamin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat, 10 mM Hepes ve 1.0 mM sodyum piruvat.
2. Efektör otoreaktif CD8 + T hücrelerinin toplanması ve aktivasyonu
NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] ve NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME) satın alınan ve fare tesiste yetiştirilen. NOD-AI4a çiftleşmelerin F1 hibrit döl NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] 3-5 yaş hafta diyabet gelişecektir. Tüm fareler spesifik patojen free tesisleri içinde yer alır ve ilgili kurum Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
- CO 2 kullanarak 3-4 hafta eski NOD-AI4a / b fareler Euthanize.
- Farelerden alınan dalak toplayın. Ötenazi fareler etanol sprey ile hazırlanan ve cerrahi kaputun altında açıldı. Dalak çıkarılır ve hemen buz HBSS tampon konur.
- 7 ml'lik cam homojenizatör kullanarak dalak hücrelerinin toplayın. İki üç dalak her 5 ml soğuk HBSS koymak ve 7 ml'lik cam homojenizatör ile homojenize edilir. Homojenat 4 1200rpm 5 dakika boyunca toplanan ve santrifüj ° C Sorvall RT7 + santrifüj kullanarak. Hücre pelletleri toplanır.
- Hipotonik çözüm tedavisi kullanarak kırmızı kan hücrelerinin çıkarın. Peletler, 5 dakika buz üzerinde çözüm / dalak 5 ml hipotonik ile tedavi edilir, daha sonra eşit miktarda HBSS ekleyerek nötralize. Yukarıdaki gibi, santrifüj hücreleri toplayın ve 50 ml HBSS tekrar süspansiyon haline getirin. Askıya alınan hücrelerin hücre süzgecinden Pass ve TrypanBlue boyama ile hemasitometre kullanarak saymak.
- Hücreleri aktive. 5x10 6 / ml ve etkinleştirmek RPMI1640 0.1 mcM AI4 mimotope (amino asit dizilimi YFIENYLEL) ve 25 U / ml, IL-2 ile 3 günlük kültür kullanarak yeniden süspanse hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 2 mM L-glutamin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat, 10 mM HEPES ve 1.0 mM sodyum piruvat.
3. 51 Cr serbest tahlil KML incelemek için
- Etiket hedef hücreleri: 1 ile 3 saat μCi / iyi ve kültür hücreleri hedef ve kültür ortamı ile 3 kere yıkayın 51 Cr ekleyin.
- Son hacmi, her bir kuyunun eklendi böylece adım 2.5 'te belirtilen RPMI 1640 orta efektör hücreleri Askıya Alma 200 ul.
- Etiketli hedef hücreleri son yıkamadan sonra, oranları: (T E) hedef, istenilen efektör hedef hücre kültürleri efektör hücreleri aktive eklemek. 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:01, 20:01 ve 50:1 T oranları: Biz genellikle E kullanabilirsiniz.
- Kendiliğinden bir parçalama kontrolü gibi hareket etmek, hedef hücrelerin 6 kuyu taze değiştirilmiş RPMI 1640 orta (2.5 adım) ekleyin.
- 16 saat boyunca ko-kültür efektör ve hedef hücreleri.
- 6x50 mm Kireç Cam tüpler supernatant toplayın
- 100μl% 2 SDS ekleme ve hafifçe birkaç kez pipetleme hücreleri Lyse.
- 6x50 mm Kireç Cam tüpler başka bir dizi hücre lizat toplayın.
- Temiz H 2 O kuyuların bir kez yıkayın ve hücre lizat tüplerine yıkama ekleyin.
- Bir gama sayacı kullanarak süpernatantlar ve hücre lizatları güvenin.
- Özel lizis aşağıdaki gibi hesaplayın:
4. Canlı hücre görüntüleme için hücrelerin boyanması
En sık kullanılan mitokondriyal membran potansiyeli boyalar arasında TMRM en mitokondriyal toksisite sergiler. Bu nedenle 3, biz bu canlı hücre görüntüleme çalışmaları için TMRM seçin.
- DMSO ve mağaza -20 ° C'de 40 mM stok TMRM çözüm hazırlayın [25 nM] NIT-1 hücre kültürü 1 için tüm takviyeleri ile fenol kırmızısı DMEM taze çalışma çözüm olun.
- 37 ° 30 dakika TMRM 25 nM hedef NIT-1 hücreleri leke ° C
- Boya 4 denge dağılımı korumak için TMRM 5 nM içeren taze medya ile medya değiştirin.
- Hematocytometer kullanarak aktive efektör AI4 T hücreleri güvenin.
- 1 ul / ml Picogreen için aktif efektör AI4 T hücreleri LekeOda sıcaklığında 5 dakika ve fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı 3 kez ile yıkayın.
5. Canlı hücre görüntüleme kullanılarak değerlendirilmesi T lenfosit aracılı beta hücre ölümü
- Odacıklı coverglass Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop aşamasında lekeli NIT hücreleri ile monte edin. Dremmel ve gaz odacıklı cam etheline oksit ile sterilize sekmesini çıkarın. Aşamada, sıcaklık 37 ° ° C ve% 5 CO 2 nem ile. Olan bir canlı hücre görüntüleme odası ile donatılmıştır .
- Aktive ekleyin ve farklı E belirlenen odalarına lekeli T hücreleri: T oranları.
- Lekeli Jurkat hücrelerinin aynı sayıda kontrol odalarına eklendi.
6. Canlı hücre görüntüler Edinme
Mikroskop, bize tekrar tekrar deney süresi boyunca otomatik olarak aynı ya da farklı odalarına farklı yerlerde görüntüler elde etmek için izin motorlu bir sahne ile donatılmıştır.
- 63x yağ objektif lens kullanarak, konumu başına 300 kare olmak üzere toplam her 3 dakikada bir aralıkta görüntüleri alır.
- Emisyon 565-619 nm eksitasyon dalga uzunluğu 543 nm ve filtre seti kullanarak TMRM boyama Algılama
- Algılama bir uyarım 488 nm ve emisyon 500-630 nm için bir filtre kullanılarak Picogreen boyama. Video Zeiss LSM yazılımı kullanılarak oluşturuldu.
7. Yayın için video dönüştürme
- Zeiss LSM yazılımı kullanarak, sıkıştırılmamış bir AVI formatında film dosyası oluşturabilirsiniz.
- Video yayınlanan biçime dönüştürmek için, video, yazılım paketi Fiji (içine ithal http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), bir ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / lokusların (Bioformats eklentisi kullanarak) dağıtım, http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Yeşil ve kırmızı sinyaller ve kare hızı, animasyon seçenekler menüsünü kullanarak, 2 kare / saniye olarak ayarlandı dengesi, parlaklık ve kontrast ayarlarını ayarlayın.
- Sıkıştırılmamış bir AVI dosyası olarak 512 x 512 piksel ve ihracat için video kırpın.
- Yazılım Quicktime 7 (Apple bilgisayar, Cupertino, CA) bu AVI dosyasını açın ve sıkıştırmak ve açık video dosyası formatı H264/MPEG-4 1200 kbs / ikinci ihracat.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
- 51 Cr KML testinin bir temsilci sonucudur. Hedef oranı (X ekseni) artar: Şekil 1, yüzde belirli lizis (Y ekseni) Efektör artar bir KML testinin temsili bir sonuç göstermektedir. Hedef hücrelerin immünyetmezligi NOD izole birincil adacıklar Rag1-/ - fareler ve 51 Cr etiketli. NOD.AI4α / β transgenik fareler izole dalak ve yukarıdaki 2. adımda açıklandığı gibi aktive edilir. Hedefler ve etkileyiciler 16 saat için ortak kültüre edildi. Yüzde özel lizis yukarıda adım 3.11 'de açıklandığı gibi hesaplanır.
- T hücre-aracılı beta hücre mitokondrial membran potansiyeli dağılımı iki temsilci (pozitif ve negatif) sonuçları sunulmaktadır. Hücreler lekeli ve reaksiyonlar adımları 4, 5 ve 6 yukarıda anlatıldığı gibi kayıt altına alınır, video dosyaları, 7. adımda olarak oluşturulur. Video 1: fare beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli boya TMRM (Kırmızı) boyandı. T oranı 50:1: Aktive, otoreaktif CD8 + T hücre AI4 (Picogreen Vitray yeşil) E bu NIT-1 hücreleri ile ortak kültüre edildi. NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli 400 dakika süresince yavaş yavaş dağıldı, ancak sadece AI4 T hücreleri ile etkileşim içinde olan kümeler. Video 2: Bir kontrol deneyi olarak, NIT-1 hücreleri TMRM ve E Picogreen lekeli Jurkat hücreleri ile ko-kültür ile boyandı: T oranı 50:1. Jurkat hücreleri MHC uyumsuz bir insan T hücre hattı. NIT-1 hücreleri co-inkübasyon süresi 400 dakika tüm süresi boyunca mitokondrial membran potansiyeli sürdürdü. Jurkat hücreleri NIT-1 kümeleri ile etkileşim yoktu ve bu nedenle öldürülmesi neden yok.
Şekil 1 KML Temsilcisi sonucu immünyetmezligi NOD.Rag1 / izole hedef hücreleri birincil adacıklar olarak kullanarak fare ve dalak NOD.AI4α / β transgenik fareler. Hedefler ve etkileyiciler 16 saat için ortak kültüre edildi. Yüzde özel lizis Efektör olarak artar: Hedef oranını yükseltir.
Video 1 Mouse beta hücre hattı NIT-1 mitokondriyal membran potansiyeli boya TMRM (Kırmızı) boyandı. Aktive otoreaktif CD8 + T hücre AI4 (Vitray Picogreen ile yeşil) bu NIT-1 E hücreleri ile ortak kültüre edildi: 50:1 T oranı. NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli dissipaTed kademeli olarak 400 dakikalık süre içinde, ama sadece yeşil AI4 T hücreleri ile etkileşim içinde olan kümeler. videosunu izlemek için tıklayın .
Video 2 Video 1 ve ko-kültür Picogreen lekeli insan T hücre hattı Jurkat açıklandığı gibi NIT-1 hücreleri aynı boyandı. NIT-1 hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyeli 400 dakika süre düşünülmüş koruyabilmiştir. NIT-1 kümeleri Jurkat hücreleri etkileşim yoktu ve bu nedenle öldürülmesi neden yok. videosunu izlemek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitotoksik T hücre aracılı beta hücre ölümü T1D 5 ana patofizyolojisi. 51 Cr sürümü kullanarak KML testleri bize efektör-hedef yanıt 6 derecesini incelemek için izin verir. Ancak, ayrıntılı bir süreç ve T hücre-aracılı beta hücre ölümü yolları hala tam olarak anlaşılmış değildir. Mitokondri, beta hücre fonksiyonu ve ölüm 7 için kritik olduğundan, görsel KML sırasında mitokondrial değişiklikler üzerine odaklanmıştır . Mitokondrial zar potansiyelini dağılımı apoptozis 8 önde gelen mitokondriyal fonksiyonel değişiklikler sırasında erken ve geri dönüşü olmayan bir adımdır. Konfokal mikroskopi canlı hücre görüntüleme yöntemi kullanarak, beta hücre mitokondrial membran potansiyeli dağılımı otoreaktif T lenfositleri ile etkileşim sırasında görselleştirmek için başardık. Bu deneysel ayar T1D beta hücrelerinin gelişimi sırasında ne olur en azından bir bölümünün taklit eder. Bu deneyde Sınırlamaları: bizim Zeiss mikroskop ile donatılmış canlı hücre görüntüleme için ısıtma eklemek Lab-Tak II odacıklı coverglass (aynı anda tedavi ve kontroller kayıt), 8-kolu iyi kullanarak, bu nedenle, 3,5 cm Petri yemekler için dizayn edilmiştir odacıklı coverglass mikroskop eklemek sığdırmak için kaldırılması gerekiyor. Ayrıca, 8-iyi Lab-Tak II odacıklı coverglass kullandığınızda 35mm Petri kabı, ısıtma eklemek için tasarlanmış olmasıdır, merkezi 4 kuyu sınırlı kalmıştır. Bu sınırlama, özellikle Zeiss Lab-Tak II odacıklı coverglass için tasarlanmış bir ısıtma eklemek yüklemesi tarafından kolayca çözülebilir. Bu deneyde genetik floresan efektör T hücreleri kullanarak, hedef hücrelere saldırmak için veya sitokinler ya da hücre-hücre etkileşimleri sinyal yollar test de dahil olmak üzere olası değişiklikler. T1D patogenezinde beta hücre ölümü, karmaşık bir süreç de dahil olmak üzere birden fazla yollar içerir ancak, granzim ve perforin 9, Fas / Fas ligand 9, sitokinler 10 ile sınırlı değil . Caspases ve piyasada mevcut granzim B floresan substratlar vardır; bu seçenekler ile yollar ve beta hücre ölümü sırasında olaylar dizisi incelemek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Üniversitesi Florida Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışmanın yanı sıra, National Institutes of Health DK074656 ve AI56374 (CEM) hibe Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
