Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

doi: 10.3791/2729 Published: May 3, 2011

Summary

الضوئية القرار المجهر الضوئي (OR - PAM) هو عبارة عن تقنية ناشئة قادرة على استيعاب التناقضات التصوير الضوئي

Abstract

وقد المجهر الضوئي ، وتوفير معلومات قيمة على المستويين الخلوي وعضية ، اعترف على نطاق واسع التكنولوجيا يعتبر الطب الحيوي مواتية. والدعائم الأساسية في الجسم الحي من ثلاثية الأبعاد (3 - D) المجهر الضوئي ، المجهر مضان single-/multi-photon والبصرية التماسك الرسم السطحي (أكتوبر) أظهرت حساسية غير عادية لمضان يتناقض نثر والبصرية ، على التوالي. ولكن ، على النقيض من امتصاص الأنسجة البيولوجية الضوئية ، والتي بترميز المعلومات الأساسية الفسيولوجية / المرضية ، لم يتم بعد تقييم.

وقد أدى ظهور photoacoustics الطب الحيوي لفرع جديد من المجهري البصرية الضوئية القرار المجهر الضوئي (OR - PAM) 1 ، حيث تركز أشعة الضوئية للحد من الانحراف لتحقيق الخلوية 1 أو حتى قرار التحت خلوية المستوى 2 الجانبي. باعتباره مكملا قيما لتكنولوجيات القائمة المجهر الضوئي ، OR - PAM يجلب اثنين على الاقل من المستجدات. الأول والأهم من ذلك ، OR - PAM يكشف تناقضات امتصاص البصرية مع حساسية غير عادية (أي 100 ٪). الجمع بين الأصالة والمعاصرة مع OR - 3 أو مضان المجهر مع الضوئية نثر المستندة 4 أكتوبر (أو كليهما) يوفر خصائص بصرية شاملة من الأنسجة البيولوجية. الثانية ، OR - PAM بترميز امتصاص الموجات الصوتية البصرية في ، على النقيض من العمليات البصرية النقية في مضان المجهري وأكتوبر ، ويوفر خلفية خالية من الكشف. كشف الصوتية في حزب الأصالة والمعاصرة ، أو يخفف من آثار تشتت بصري على تردي الإشارة ويلغي بطبيعة الحال تدخلات ممكنة (أي crosstalks) بين الإثارة والكشف ، وهي مشكلة شائعة في مضان المجهري نظرا للتداخل بين الإثارة والأطياف مضان.

فريدة من نوعها للتصوير الضوئي الامتصاص ، وقد أثبتت OR - PAM التطبيقات الطبية الحيوية واسعة منذ اختراع ، بما في ذلك ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، الأعصاب 5 ، 6 ، طب العيون 7 و 8 و البيولوجيا الوعائية 9 ، و 10 الأمراض الجلدية. في هذا الفيديو ، ونحن نعلم تكوين النظام والمواءمة بين الأصالة والمعاصرة ، أو فضلا عن الإجراءات التجريبية لتصوير الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وظيفية.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. نظام التكوين

  1. البصري تشعيع
    1. مصدر الإشعاع الضوئي : الصمام الثنائي ضخ الصلبة للدولة نابض الليزر (INNOSLAB ، Edgewave) وصبغ ليزر (CBR - D ، السيرة).
    2. وتركز عدسة مكثف من قبل (LA1131 ، Thorlabs) لتمر من خلال ثقب صغير 50 ​​ميكرومتر (P50C ، Thorlabs) : شعاع الليزر الناتج (7 نانوثانية نبض العرض).
    3. يتم وضع الثقب بعيدا قليلا عن بؤرة العدسة المكثف لمباراة قطر الثقب مع قطر شعاع الأساسية في الوضع المكاني لتصفية فعالة.
    4. شعاع تصفيتها هو الموهن من تصفية محايدة الكثافة (NDC - 50C - 2M ، Thorlabs) ثم إضافة إلى واحد من الألياف البصرية وضع (P1 - 460A - FC - 2 ، Thorlabs).
    5. إخراج الألياف يملأ الفتحة الخلفية هدفا المجهر (RMS4X ، Thorlabs) لتحقيق التركيز حيود محدودة البصرية 2.6 ميكرومتر ~ في الطول الموجي من 570 نانومتر.
  2. الكشف بالموجات فوق الصوتية
    1. محول بالموجات فوق الصوتية : 50 ميغاهرتز وسط تردد (V214 - BB - RM ، أوليمبوس ، NDT).
    2. يتم إرفاق محول بالموجات فوق الصوتية لالموحد محلية الصنع الصوتية البصرية شعاع 11 للكشف عن الموجات فوق الصوتية ، والتي تتماشى مع محوري حيود الأشعة الضوئية محدودة.
    3. هي الأرض كروية وتجويف للخروج من قاع الموحد لإنتاج عدسة الصوتية. هذه العدسة الصوتية له فتحة عددية قدرها 0.5 في الماء ويعطي قطر الصوتية البؤرية من 43 ميكرومتر في وسط تردد 50 ميغاهرتز.
    4. يتم محاذاة البؤر الضوئية والصوتية confocally لزيادة حساسية الكشف.
  3. اقتران الصوتية
    1. يعمل بالموجات فوق الصوتية اقتران الجافة لتجنب غمر حيوانات التجارب في مجال المياه ، والتي كانت تستخدم في وقت مبكر نظم التصوير الضوئي 12.
    2. يتم فتح نافذة التصوير في الجزء السفلي من طبق بيتري (9 سم في القطر) ومختومة مع غشاء شفاف البولي بالموجات فوق الصوتية وبصريا.
    3. هلام بالموجات فوق الصوتية (صورة واضحة ، SonoTech) بين الغشاء البولي اثيلين والكائن إلى أن الأزواج تصوير الضوئي ولدت موجة من الاعتراض على طبق بيتري ، والماء منزوع الأيونات في طبق بتري الأزواج كذلك موجة لرئيس المغمورة التصوير OR - PAM .
  4. إلكترونيات
    1. إشارة يتم تضخيمه الضوئي الكشف عنها بواسطة محول بالموجات فوق الصوتية من قبل اثنين من مكبرات الصوت تتالي (ZFL 500LN ، ميني الدوائر)
    2. هو إشارة رقمية تضخيمها من قبل الحصول على بيانات 14 بت (دق) متنها (14200 CompuScope ، غيج العلوم التطبيقية) بمعدل عينة من 200 MS / ثانية.
  5. نظام المسح الضوئي
    1. يتم التحكم ثنائية الأبعاد (2 - D) النقطية مسح الرأس التصوير OR - PAM على طول الطائرة (س ص) الأفقي جهاز كمبيوتر شخصي ، والذي يطلق على كل من مجلس دق والليزر المضخة. مزامنة إشارة الزناد مع اشارة عقارب الساعة التدريجي من مجلس دق.
    2. يتم تعريف سريع للمحور الماسح 2 - D واتجاه مسح مستعرضة (B - المسح).
    3. يمكن الحصول على تسلسل من B - مسح الصور عن طريق ترجمة الرأس على طول محور التصوير البطيء لتكوين صورة الحجمي ، التي يمكن الاطلاع عليها سواء في تقديم 3 - D المباشرة أو في إسقاط الحد الأقصى لسعة 2 - D (MAP) صورة .

2. نظام التوافق

  1. استخدام الموجات فوق الصوتية نبض الصدى وعاكس بالموجات فوق الصوتية لتحديد موقع الطائرة الاتصال الصوتي (أي تأخير الوقت من إشارة الزناد إشارة إلى نبض الصدى أقصى بالموجات فوق الصوتية). مطلوب هذه الخطوة التي يتعين القيام بها مرة واحدة فقط عند بناء نظام OR - PAM.
  2. تعظيم كفاءة اقتران الألياف أحادية النمط.
  3. تطبيق هلام بالموجات فوق الصوتية على رأس كائن استيعاب بصريا (على سبيل المثال ، قطعة من الشريط الأسود) وإرفاق برفق تحت نافذة التصوير في طبق بتري ملئت ماء منزوع الأيونات.
  4. تخفيض رأس التصوير في الماء ، وإزالة فقاعات الهواء محاصرين تحت العدسة الصوتية.
  5. ضبط مدير التصوير الضوئي حتى إشارة للكائن هو استيعاب طائرة من الاتصال الصوتي ، والتي يمكن أن يحكم من التأخير الصوتية.
  6. ضبط الوضع الرأسي (أي موقف ض) هدف المجهر لتحقيق أقصى قدر من السعة للإشارة الضوئي ولدت من كائن مسطح. السعة مكبر إشارة إلى أن يتم محاذاة التركيز البصري السمعي مع التركيز في الاتجاه الرأسي.
  7. توفيق أوضاع الأفقي (أي x و y وظيفة) هدف المجهر الضوئي حتى إشارة ولدت من الهدف يظهر نمط متماثل. التماثل يوحي بأن يتم محاذاة التركيز البصري السمعي مع التركيز في الاتجاه الأفقي.
  8. كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 حتى يتم تحسين إشارة الضوئي في كل من التماثل والسعة.

3. A سا الإجراء التجريبي في mple فيفو OR - PAM من الماوس الأذن الأوعية الدموية

  1. غير مطلوبة هذه الخطوة من أجل الفئران عارية. تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من كوكتيل [وصفة : 1 مل الكيتامين (100 ملغ / مل) ، و 0.1 مل زيلازين (100 ملغ / مل) ، و 8.9 مل المالحة ؛ الجرعة : 0.1 ml/10 ز]. حلق الشعر في الأذن ، وكذلك يزيل الشعر الشعر المتبقية مع كريم SURGI (الفئة # : 82565 ، الاميركية الدولية للصناعات) قبل تنظيفها بالماء منزوع الأيونات. علما بأن إزالة الشعر من هذا القبيل قد تهيج الجلد قليلا الأوعية الدموية ، وبالتالي يتم تنفيذ أفضل قبل 24 ساعة من التجربة المزمعة.
  2. بدوره على نظام الليزر الضوئي ، والتحقق من المحاذاة النظام.
  3. تخدير الفأر مع 3 ٪ isoflurane المتبخرة من استنشاق الغاز (معدل تدفق نموذجي هو 1،0-1،5 لتر / دقيقة ، اعتمادا على وزن جسم الحيوان) ، والحفاظ على التخدير مع 1 ٪ isoflurane في كافة مراحل التجربة. ينصح الطبية الصف الهواء كما استنشاق الغاز للحفاظ على الماوس في حالة فسيولوجية طبيعية.
  4. نقل الماوس إلى مرحلة المجسم ، والتحكم في درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية مع وسادة التدفئة.
  5. تتسطح الأذن الماوس على لوحة بلاستيكية وتطبيق طبقة من الهلام الموجات فوق الصوتية في أعلى الأذن. تجنب احتباس فقاعات الهواء داخل الجل. ثم ، ضع الأذن التصوير تحت النافذة ورفع ببطء في المرحلة الحيوانية إلى أن اتصالات الموجات فوق الصوتية هلام الجزء السفلي من الغشاء البولي اثيلين. مطلوب اللاصقة اللينة بسبب الضغط على الأذن ضد الغشاء قد يؤثر على تدفق الدم في الأذن.
  6. المشبك a نبض oximeter في ساقه الماوس أو الذيل لمراقبة حالتها الفسيولوجية ، وتطبيق مرهم للعين لمنع جفاف والتلف العرضي ليزر للعيون الماوس.
  7. خفض رأسه حتى يتم التصوير عدسة مغمورة في الماء منزوع الأيونات الصوتية ، وإزالة فقاعات الهواء محاصرين تحت العدسة الصوتية.
  8. التحقق من فلوينس الليزر للتأكد من وجوده ضمن معايير السلامة ليزر للمعهد الوطني الأمريكي للمعايير 13. ينبغي أن فلوينس الليزر لا تتجاوز 20 مللي جول / سم 2 ، وهو ما يترجم إلى 80 نيوجيرسي الطاقة نبضة ليزر عندما تركز شعاع الليزر في 150 ميكرون تحت سطح الجلد.
  9. ضبط الليزر لوضع الخارجي الزناد وبدء المسح الضوئي للمحاكمة. ضبط الموقف ض الرأس حتى التصوير الضوئي أقواهما هو من الطائرة الاتصال الصوتي.
  10. تعيين المعلمات الصحيح المسح والبدء في الحصول على الصور الرسمية.
  11. بعد التجربة ، وإيقاف ليزر ، ورفع الرأس التصوير خارج الماء منزوع الأيونات ، وانخفاض في المرحلة الحيوانية إلى إطلاق سراح الفأر ، وتنظيف الأذن الفأر مع الماء منزوع الأيونات ، إيقاف نظام التخدير وتحكم في درجة الحرارة ، وتفريغ الماوس من مرحلة المجسم.
  12. إذا كان المطلوب تصوير المتكررة ، ووضع الماوس في حاضنة مع درجة حرارة البيئة التي حددت في 37 درجة مئوية. عودة الماوس إلى منشأة الحيوان بعد أن يستيقظ بشكل طبيعي. خلاف ذلك ، اتبع بروتوكولات الحيوانية لeuthanatize والتخلص منها.

4. وظيفية أو حزب الأصالة والمعاصرة ، من التركيز الكلي وتشبع الأوكسجين من الهيموغلوبين

  1. الأوكسي هيموغلوبين (HBO 2) وديوكسي هيموغلوبين (HBR) هي الأشكال الرئيسيتين من الهيموغلوبين ، والغالب المصدر الضوئي الذاتية في النطاق الطيفي المرئي. HBO 2 و HBR ومتميزة الأطياف امتصاص البصرية ، وبالتالي يمكن أن تكون متمايزة طيفيا لقياس التركيز الكلي على حد سواء (HBT) وتشبع الأوكسجين (SO 2) من الهيموغلوبين 5. هنا مجموعتان من المبادئ التوجيهية للمساعدة في اختيار المناسب للموجات الضوئية قياسات 2 بحيث :
  2. يجب أن يتم تحديد موجات داخل Q - الفرقة من الهيموغلوبين طيف الامتصاص (أي 550-600 نانومتر) لضمان وجود ما يكفي من الإشارات إلى نسبة الضوضاء والاختراق الكافي.
  3. ينصح موجات حيث معاملات امتصاص HBO 2 و HBR يملك الفرق واضح (على سبيل المثال ، HBR المهيمنة نانومتر 561 و HBO 2 - المهيمنة 578 نانومتر).

إلى جانب ذلك 2 ، يمكن حساب HBT بإضافة [HBR] و [HBO 2] معا ، أو يمكن قياسه مباشرة على موجات isosbestic من الأطياف الانقراض المعامل المولي من الهيموغلوبين (مثلا ، 530 نانومتر ، 545 نانومتر ، 570 نانومتر ، و 584 نانومتر) 14 ، حيث HBR وHBO 2 متساوية معاملات المولي الانقراض.

5. ممثل النتائج :

هو مبين في الشكل رقم 1 هو تشريح الأوعية الدموية وذلك في 2 الأذن الماوس يعيشون عراة التقط بواسطة الطول الموجي المزدوج (561 و 570 نانومتر) أو حزب الأصالة والمعاصرة. والحصول على الصور النمطية الوقت لذلك الطول الموجي المزدوج 2 قياسات مثل هذه المنطقة من الفائدة (حجم الصورة : 10 ملم × 10 ملم ، وحجم الخطوة : 2.5 ميكرومتر × 5 ميكرون) هو ~ 80 دقيقة.

p_upload/2729/2729fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. المجهر الضوئي في الاستبانة فيفو الضوئي. صور خريطة (أ) تركيز الهيموغلوبين مجموع يظهر تشريح الأوعية الدموية (المكتسبة في 570 نانومتر) و (ب) الأكسجين تشبع الهيموجلوبين (المكتسبة في 561 نانومتر ونانومتر 570) في أذن الفأر عارية. (C) عن قرب في المنطقة محاصر في لوحة (A). شريط النطاق في لوحة (أ) ينطبق على كل من (أ) و (B)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا الفيديو ، ونحن نقدم تعليمات مفصلة بشأن البروتوكولات التجريبية OR - PAM ، بما في ذلك تكوين النظام ، والمحاذاة النظام ، والإجراءات التجريبية النموذجية. وقد مكن حزب الأصالة والمعاصرة أو التسمية خالية من موسع دراسات أداء الاوعية الدموية الدقيقة والتمثيل الغذائي على أساس شعري واحد ، ويحمل بالتالي القدرة على توسيع فهمنا للدوران الأوعية الدقيقة المتصلة الفيزيولوجيا وعلم الأمراض. Microphotoacoustics حاليا بتصنيع هذا النظام OR - PAM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ونفذت جميع الإجراءات على حيوانات التجارب في المختبرات التوافق مع بروتوكول الحيوانية المعتمدة من قبل كلية الطب للدراسات اللجنة الحيوان من جامعة واشنطن في سانت لويس.

Acknowledgments

قراءة الكتاب نقدر الدكتور Lynnea Brumbaugh المقربين من المخطوطة. وقد رعت هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EB000712 R01 ، R01 EB008085 ، CA134539 R01 ، U54 CA136398 وDK02057933 5P60. البروفيسور وانغ Lihong خامسا له مصلحة مالية في Microphotoacoustics ، وشركة Endra ، وشركة ، والتي ، مع ذلك ، لا تؤيد هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Home-made acoustic-optical beam combiner:
right-angle prism Edmund Scientific NT32-545
rhomboid prism Edmund Scientific NT49-419
silicone oil Clearco Products 1000cSt
OR-PAM system Microphotoacoustics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).
  2. Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo. Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).
  4. Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).
  5. Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).
  6. Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).
  7. Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography. Opt. Lett. 35, 1-3 (2010).
  8. Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).
  9. Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence. Blood. Forthcoming Forthcoming.
  10. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).
  11. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).
  12. Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).
  13. Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136. American National Standards Institute Inc. New York, NY. (2007).
  14. Jacques, S. L., Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin . Oregon Medical Laser Center [Internet]. Available from: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html (1999).
ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J. Vis. Exp. (51), e2729, doi:10.3791/2729 (2011).More

Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J. Vis. Exp. (51), e2729, doi:10.3791/2729 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter