Summary
Эндоплазматическая сеть играет ключевую роль в биогенеза белка и кальция гомеостаза. Мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам рассмотреть роль Са2 + каналы утечки и охарактеризовать их предполагаемыми регулирующих механизмов. Эта система включает в себя миРНК опосредованного глушителей гена и живой клетки Ca2 + изображений.
Abstract
В клетках млекопитающих, эндоплазматический ретикулум (ER), играет ключевую роль в биогенеза белка, а также в кальциевой сигнализации 1. Гетеротримерные Sec61 комплекса в мембране ЭР обеспечивает водный путь для вновь синтезированных полипептидов в просвет ЭР. Последние работы из разных лабораторий предположил, что это гетеротримерные комплекс может также образуют переходные Ca 2 + каналы утечки 2-8. Ключевое наблюдение за этим понятием было то, что освобождение зарождающейся полипептидов из рибосомы и Sec61 комплекс пуромицином приводит к переходным выпуском Са 2 + из ER. Кроме того, было отмечено, что в пробирке ER просвета белка BiP участвует в предотвращении ионной проницаемости на уровне 9,10 Sec61 комплекса. Мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам напрямую обратиться к роли Sec61 комплекса в качестве потенциальных Са 2 + канал утечки и охарактеризовать ее предполагаемых механизмов регулирования 11-13. Эта система сочетает в себе миРНК опосредованного глушителей гена и живой клетки Са 2 + изображения 13. Клетки обрабатывали siRNAs, которые направлены против кодирования и нетранслируемой области (УТР), соответственно, SEC61A1 гена или отрицательный миРНК контроля. В дополнении анализа, клетки совместно трансфицированных IRES-GFP вектор, который позволяет миРНК устойчивые выражения дикого типа SEC61A1 гена. Затем клетки загружены логометрических Са 2 +-индикатор FURA-2 для контроля одновременно изменения в цитоплазме концентрации Са 2 + в число клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Непрерывное измерение цитозольного Са 2 + также позволяет оценить влияние различных агентов, таких как пуромицин, небольшие молекулы ингибиторов, а thapsigargin на Са 2 + утечки. Эта экспериментальная система дает нам уникальные возможности я) оценить вклад различных мембранных белков ER к пассивному Са 2 + истечение из ЭР в различных типах клеток, II) характеризуют белков и механизмы, которые ограничивают это пассивная Са 2 + истечения, и III) изучить последствия болезни связаны мутации в соответствующих компонентов.
Protocol
1. Подготовка исходных растворов
- Подготовка кальция без буфера (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 0,5 мМ EGTA, 10 мМ глюкозы в 10 мМ HEPES-КОН (рН 7,35)).
- Растворения FURA-2 утра в ДМСО для получения 1 мМ маточного раствора. Смешайте использованием вихрь, пока раствор не однородно желтого света. Защита чашки от света месте. Развести FURA-2 утра маточного раствора в 1 мл Дульбеко изменение орел среды (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин, чтобы конечная концентрация 4 мкМ для загрузки клеток HeLa.
- Подготовка 12,5 мм пуромицин маточного раствора в дистиллированной воде (рН 7,0). Магазин аликвоты при -20 ° C. Развести 12,5 мм пуромицин маточного раствора в бескальциевой буфер конечной концентрации 500 мкМ пуромицин.
- Растворите thapsigargin в ДМСО для получения 1 мМ маточного раствора.
- Растворить 1 мг ophiobolin в 20 мкл хлороформа, а затем смешивают с 25 мкл ДМСО. Микроцентрифужных трубки остается открытым до хлороформ испаряется. Таким образом, окончательный ophiobolin концентрация составляет 100 мм. Магазин аликвоты при -20 ° C. Перед применением, разбавленные растворы в бескальциевой буфер конечной концентрации 100 мкМ. Таким образом, конечная концентрация ДМСО для живого изображения ячейки не превышает 0,1%.
- Растворите трифлуоперазин в ДМСО до концентрации 10 мМ и хранить аликвоты при -20 ° C. Разбавьте растворы в бескальциевой буфера в конечной концентрации 10 мкМ до использования. Таким образом конечная концентрация ДМСО для живого изображения клетки, как и для ophiobolin, не превышает 0,1%.
- Растворите siRNAs (SEC61A1 миРНК, SEC61A1-УТР миРНК и контроля миРНК) в РНКазы свободной воды для приготовления 20 мкМ исходного раствора. Смешайте использованием вихревой и наблюдать солюбилизации на глаз. Магазин 50 мкл аликвоты при -20 ° C.
2. Генов в клетках HeLa
С целью изучения вклада определенных белков в ЭР Са 2 + истечение, соответствующего гена должна быть эффективно замолчать с двумя разными siRNAs (рис. 1). Кроме того, эффект подавления должно быть преодолено путем экспрессии соответствующего гена дикого типа. Обычно мы используем siRNAs, которые направлены против кодирования и некодирующих (УТР) области, соответственно, интересующего гена. Используя УТР-направленного миРНК обеспечивает удобный способ для дополнения.
- Семенной 5,2 х 10 5 HeLa клетки (АТСС нет. CCL-2) в 6 см культуры блюдо с 25 мм покровным стеклом (предварительно обрабатывают 200 мкл поли-L-лизин (1 мг / мл) в течение 1 ч) В Дульбеко изменение орел среды (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина и инкубировать при температуре 37 ° C во влажной среде с 5% СО 2 (конечный объем 3,9 мл).
- Трансфекции клеток с SEC61A1 миРНК, SEC61A1-УТР миРНК, или отрицательное управление с помощью миРНК HiPerFect реагент в соответствии с инструкциями производителя (конечная концентрация миРНК: 20 нм). Одним словом, подготовить siRNAs недавно в отдельной трубке микроцентрифужных до фактического процедуры трансфекции: Добавить 20 мкл реагента HiPerFect трансфекции до 4 мкл каждого миРНК (20 мкМ), который растворяют в 80 мкл OptiMEM. Эта смесь осторожно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить миРНК смеси (104 мкл) по каплям к посеяны 5,2 х 10 5 HeLa клетки (3,9 мл).
- Через 24 ч, изменение среды (3,9 мл) и трансфекции клеток для второй раз с тем же смесь миРНК (104 мкл).
- Оценка глушителей по-блот-анализ западных. Она должна быть выше 80%. Вымойте клетки блюдо культуры клеток в фосфатно-солевом буфере (PBS) и собирать их в DMEM. Граф клетки, используя графиня Автоматизированный счетчик Cell. Lyse клетки в ячейке буфера для лизиса (10 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 3 мМ MgCl 2, 0,5% NP40) с добавлением ингибитора протеазы-коктейль (3 мкг / мл пепстатина, 3 мкг / Leupeptin мл, 3 мкг / мл Антиболь, 3 мкг / мл Chymastatin) и смешать с SDS-образец буфера (60 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанол, 0,01% бромфенол синий ), чтобы получить конечную концентрацию 10,000 клеток / мкл. Тепло образцов при 56 ° С в течение 15 мин, а затем добавить несколько стеклянных бусин и вихрей в течение 20 мин до фрагмент ДНК. Отдельные 20 мкл каждого образца на Laemmli типа SDS-PAGE (обычно 15% polyacrylamid для разделения гель). Передача разделенных на белки мембраны PVDF по electroblotting ("мокрого пятна") при постоянной 400 мА в течение 3 часов или на ночь в переводе буфера (100 мМ глицина, 12,5 мМ Трис-HCl). После этого блок с 5% (м / о) обезжиренного сухого молока в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем выставить пятно на первичные антитела, направленные против С-конце Sec61α из кролика и анти-β-актин- антитела из мыши. Вымойте пятном в PBS-TritonX-100 (0,05%) и тwice в PBS в течение 5 мин, соответственно. Визуализация первичных антител использованием ECL Plex коза-анти-IgG кролика-Cy5 или ECL Plex коза-анти-мышиных IgG-Cy-3-сопряженных и Тайфун-Трио визуализации системы в сочетании с изображения Квант TL программного обеспечения 7.0. В случае SEC61A1 гена, максимальный эффект глушителя как правило, рассматривается 96 ч после первого трансфекции. Представитель эксперимента приведена на рис. 2.
3. Комплементации клеток HeLa
Для того, чтобы спасти фенотип SEC61A1 глушителей, SEC61A1 кДНК была вставлена в сайт множественного клонирования (MCS) из-pcDNA3 внутреннего рибосомного сайта въезд (IRES)-GFP-вектор, который содержал цитомегаловирус (ЦМВ) промоутер, MCS, IRES, плюс зеленый белок fluoresecent (GFP) кодирующей последовательности.
- 48 ч после первого трансфекции миРНК, обмен средний (3,9 мл) в течение второй раз и трансформировать клетки либо с пустой вектор или SEC61A1 плазмиды экспрессии использованием Fugene HD согласно протоколу производителя (окончательное отношение вектора Fugene HD составляет 4 мкг вектор до 16 мкл Fugene HD). Одним словом, подготовка плазмид недавно в отдельной трубке микроцентрифужных до Процедура преобразования: Добавить 16 мкл Fugene HD преобразование реагента до 4 мкг каждого плазмиды, которые растворяют в 80 мкл OptiMEM. Аккуратно вихрь эту смесь и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить плазмиды смесь (0,1 мл) по каплям к посеяны 5,2 х 10 5 HeLa клетки (3,9 мл).
- Через 48 ч плазмиды выражении, с учетом блюда культуры флуоресцентной микроскопии до визуализации кальция и уборки урожая. При необходимости заменить DMEM по PBS для лучшего сигналов флуоресценции. Запись флуоресцентные изображения на флуоресцентный микроскоп оснащен охлаждением ПЗС-камерой. Преобразование эффективность может быть определена путем деления числа клеток, воспроизводящих GFP флуоресценции клетки учитываются в режиме светлого и должна быть выше 80%. Типичный результат показан на рис. 3.
4. Живая клетка изображений кальция
- До измерения, передачи покровным стеклом покрытые трансфицированных клеток HeLa в отдельном блюде 3,5 см культуры. Нагрузка клеток с 4 мкМ FURA-2 утра в 1 мл DMEM течение 45 мин при 25 ° С в темном 11,12.
- Fix 25 мм покровным стеклом в IMIC камере металл и промыть клетки в два раза и инкубировать в бескальциевой буфера (каждый раз по 300 мкл).
- Начало сбора данных о IMIC микроскоп с полихромной V поочередно захватывающих при 340 нм и 380 нм и измерения излучаемой флуоресценции при 510 нм (Filter набор: светоделителя, 565 нм, излучатель, 605/70 нм). Примеры изображений, содержащих 20-50 клеток / кадра каждые 3 сек Запись FURA-2 сигналы, как отношения F340/F380, где F340 и F380 соответствуют фона вычитается интенсивность флуоресценции при 340 и 380 нм соответственно.
- Через 1 мин, лечить клетками с пуромицином (500 мкМ) в кальции без буфера или с тем же буфером. Кроме того, лечить клетками с небольшой молекулы ингибитора (например, 10 трифлуоперазин мкМ и 100 мкМ ophibolin) или с кальцием без буфера.
- После логометрических измерения проводятся в течение 2 или 10 минут, добавить thapsigargin (1 мкМ) и продолжить измерения.
- В конце концов, cytoslic [Са 2 +] оценивается по отношению измерения создан метод калибровки. 2 Анализ данных Excel 2007 и происхождение 6.1.
5. Представитель Результаты:
До сих пор мы обратились к вопросу о том молчание SEC61A1 ген влияет на кальций (Са 2 +) утечки из ER (рис. 1). Ген SEC61A1 был подавлен два разных siRNAs в клетках HeLa в течение 96 часов. Хотя вряд ли глушителей пострадавших клеточного роста и жизнеспособности, транспортного белка в ER полу-проницаемыми клеток почти полностью подавляется. Кроме того, SEC61A1 замолчать клетки пострадавших по отношению к Са 2 + утечки из ER. Влияние генов было отменено выражение SEC61A1 гена. Таким образом, Sec61 комплексов, которые присутствуют в ER мембранные всех ядерных клеток форме Са 2 + утечка каналов, которые можно будет играть решающую роль в Ca 2 + гомеостаза. Тем не менее, наличие большого, заполненные водой поры с неконтролируемой проницаемости ионных, так как образованные Sec61 комплексов в мембране ЭР, будет серьезно мешать регулируемого выпуска Са 2 + из просвета ER в цитозоле, важным механизмом внутриклеточного сигнализации. Мы определили кальмодулин (CAM) обязательным мотивом в цитозольного N-конце млекопитающих Sec61α, что связано СаМ но не Са 2 +-свободный apocalmodulin с наномолярных близости и последовательности специфику. На клеточном уровне, два разных антагонистов СаМ стимулировали Ca
Рисунок 1. Блок-схема. См. текст для деталей.
Рисунок 2. Анализ данных для глушителей эффективности. Отключение оценивали по Вестерн-блот анализ с использованием антител, которые были направлены против Sec61α и β-актин (загрузка контроля). Первичных антител были визуализированы с помощью ECL Plex вторичных антител и флуоресценции.
Рисунок 3. Анализ данных для эффективности трансфекции. Изображения были записаны на флуоресцентный микроскоп оснащен охлаждением ПЗС-камерой. Преобразование эффективность может быть определена путем деления числа клеток, воспроизводящих GFP флуоресценции клетки учитываются в режиме светлого.
Рисунок 4. Скриншоты из живых изображений кальция клетка клеток HeLa в наличии контрольно-или SEC61A1-миРНК и наличие или отсутствие CAM-антагонист ophiobolin А. клетках HeLa лечили миРНК направлена против SEC61A1 (B) или отрицательные миРНК управления () в течение 96 ч, как указано. Эти клетки были загружены с кальцием индикатор FURA-2 АМ и инкубировали в Са 2 + свободный буфер, содержащий 0,5 мМ EGTA, то буфер или ophiobolin (Ophio) в буфере был добавлен и инкубации возобновились. Через 10 мин, Ca 2 +-релиз был инициирован применением thapsigargin (ТГ) в отсутствие внешнего Са 2 + и инкубации была продолжена. Скриншоты из непрерывного изображения кальция были сделаны в указанных раза.
Рисунок 5. Анализ данных для живых экспериментов кальция клетка изображений. () Кинетические и количественного анализа серии экспериментов, как показано на рис. 4А. Cytoslic [Са 2 +] оценивалась по отношению измерения создан метод калибровки 2. Влияние thapsigargin показан как бар диаграммы. (BD) клетки обрабатывали миРНК управления или указанного SEC61A1-миРНК в течение 48 ч, а затем трансформированных либо векторное управление (C), или SEC61A1 выражение плазмиды (С) или мутант SEC61A1 выражение плазмиды (D), как указано. Через 48 ч, эксперименты кальция изображения проводились как на рис 4 и 5А. Статистический анализ изменений в цитоплазме концентрации Са 2 + после добавления thapsigargin в экспериментах, например, представлены в показаны. Значения Р <0,001 были определены как значительные по непарным т тест и отмечены тремя звездочками (***), нс, не имеет значения. Количество клеток, которые были проанализированы указаны. Средние значения заданы, погрешности представляют собой стандартные ошибки средних (SEM). Заметим, что эти примеры были адаптированы из работы. 13.
Рисунок 6. Эти данные показывают, что освобождение зарождающейся цепи из Sec61 комплекс действительно приводит к кальций освобождение от ЭР и формирование кальция nanodomain вокруг цитозольного устье Sec61 комплекса. Это кальций связан кальмодулин и кальций-кальмодулин закрывает Sec61 комплекса ".
Discussion
В клетках млекопитающих, эндоплазматический ретикулум (ER), играет ключевую роль в биогенеза белка, а также в кальциевой сигнализации. Здесь мы описали экспериментальная система, которая позволяет нам напрямую обратиться к роли одного потенциального Са 2 + канал утечки и охарактеризовать ее предполагаемых механизмов регулирования 13. Эта экспериментальная система дает нам уникальные возможности я) оценить вклад различных мембранных белков ER к пассивному Са 2 + истечение из ЭР в различных типах клеток, II) характеризуют белков и механизмы, которые ограничивают это пассивная Са 2 + истечения, и III) изучить последствия болезни связаны мутации в соответствующих компонентов.
Заметим, что только жизнеспособные клетки должны быть проанализированы и что в целом жизнеспособность должна быть выше 80%. Таким образом, жизнеспособность клеток регулярно оценивается применением ядерного ID синий / зеленый реагент жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом производителя. Кроме того, статистический анализ изменений в цитоплазме концентрации Са 2 + является обязательным. Таким образом, эксперименты должны быть проведены в течение четырех различных партий клеток и два покровных, по крайней мере 20 ячеек должны быть проанализированы для каждого условия в одном эксперименте. Отметим, что различные эксперименты должны проводиться в то же время после посева на обложке скользит.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
SL была поддержана общение с DFG (Graduate исследовательская школа 845). Эта работа была поддержана грантами DFG (SFB 530/C1 И ДЛЯ 967) и HOMFOR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| Penicillin/ Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 | |
| Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| Trifluoperazine | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | ||
| TE2000-S microscopewith DS-5Mc camera | Nikon Instruments | ||
| iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |
References
- Clapham, D. E. Calcium signalling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).
- Van Coppenolle, F. Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores. J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).
- Flourakis, M. Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation. FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).
- Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).
- Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).
- Amer, M. S. Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).
- Tu, H. Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations. Cell. 126, 981-993 (2006).
- Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell. 92, 747-758 (1998).
- Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).
- Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells. J. Immunol. 174, 119-130 (2005).
- Gross, S. A. TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels. J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).
- Erdmann, F. Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. EMBO J. 30, 17-31 (2011).
