Summary
Det endoplasmatiska retiklet spelar en viktig roll i protein biogenes och kalcium homeostas. Vi har etablerat ett experimentellt system som tillåter oss att hantera rollen som Ca2 + läcker kanaler och att karakterisera deras förmodade regleringsmekanismer. Detta system innebär siRNA medierad geners uttryck och levande cell Ca2 + avbildning.
Abstract
I däggdjursceller spelar endoplasmatiska retiklet (ER) en avgörande roll i protein biogenes samt i kalcium signalering 1. Den heterotrimeric Sec61 komplex i ER membranet ger en vattenlösning väg för nyligen syntetiserade polypeptider i lumen i ER. Senare verk från olika laboratorier föreslagit att denna heterotrimeric komplex även kan bilda övergående Ca2 + läcker kanalerna 2-8. Den viktigaste observationen för denna uppfattning var att utsläpp av begynnande polypeptider från ribosomen och Sec61 komplex av puromycin leder till övergående frisättning av Ca 2 + från ER. Dessutom hade det varit observerats in vitro att ER luminala proteinet BIP är engagerade i förebyggande jon permeabilitet i nivå med de Sec61 komplexa 9,10. Vi har etablerat ett experimentellt system som tillåter oss att direkt ta itu med den roll som Sec61 komplexa som potentiella Ca 2 + läcka kanal och för att karaktärisera dess förmodade reglerande mekanismer 11-13. Detta system kombinerar siRNA tysta medierad gen och levande celler Ca 2 + avbildning 13. Celler behandlas med siRNA som är riktad mot kodning och oöversatta regionen (UTR) respektive den SEC61A1 gen eller en negativ kontroll siRNA. I komplement analys är de celler tillsammans transfekterade med en IRES-GFP vektor som låter siRNA-resistenta uttryck för wildtype SEC61A1 genen. Då cellerna laddas med ratiometrisk Ca 2 +-indikator Fura-2 för att övervaka samtidigt förändringar i cytosoliskt Ca 2 + koncentrationen i ett antal celler via ett fluorescensmikroskop. Kontinuerliga mätningar av cytosolic Ca 2 + möjliggör också en utvärdering av effekterna av olika aktörer, såsom puromycin, små hämmare molekyl, och thapsigargin om Ca 2 + läckage. Detta experimentella system som ger oss unika möjligheter att i) utvärdera bidraget från de olika ER membranproteiner till passiva Ca 2 + utflödet från ER i olika celltyper, ii) karakterisera proteiner och mekanismer som begränsar denna passiva Ca 2 + efflux, och iii) studera effekterna av sjukdomen kopplade mutationer i relevanta delar.
Protocol
1. Beredning av stamlösningar
- Förbered kalcium-buffert (140 mM NaCl, 5 mm KCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EGTA, 10 mm glukos i 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)).
- Löses Fura-2 AM i DMSO att få en en lösning mM lager. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är homogent ljusgul. Skydda kopp från ljus. Späd Fura-2:00 stamlösning i 1 ml Dulbecco ändrade eagle medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin till en slutlig koncentration 4 mikroM för lastning av HeLa celler.
- Förbered en 12,5 mm lösning puromycin lager i destillerat vatten (pH 7,0). Förvara alikvoter vid -20 ° C. Späd 12,5 mm lösningen puromycin lager i kalcium-buffert till en slutlig koncentration av 500 mikroM puromycin.
- Lös thapsigargin i DMSO att få en en lösning mM Stock.
- Löses 1 mg ophiobolin A i 20 l kloroform och därefter blanda med 25 l DMSO. Den mikrocentrifugrör är öppen fram kloroform förångas. Således den slutliga ophiobolin En koncentration är 100 mm. Förvara alikvoter vid -20 ° C. Före användning, späd stamlösningar till kalcium-buffert till en slutlig koncentration av 100 mikroM. Därmed överstiger sista DMSO koncentrationen för levande cell imaging inte 0,1%.
- Lös trifluoperazine i DMSO till en koncentration på 10 mm och alikvoter förvara vid -20 ° C. Späd stamlösningen till kalcium-buffert till en slutlig koncentration av 10 mikroM före användning. Således sista DMSO koncentrationen för levande cell imaging, som till ophiobolin A, inte överstiger 0,1%.
- Lös siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA och kontroll siRNA) i RNas fritt vatten för att förbereda en 20-lösning mikroM lager. Blanda med hjälp av en virvel och observera lösningsgörande av ögat. Store 50 l alikvoter vid -20 ° C.
2. Utsläckning av geners uttryck i HeLa celler
För att studera bidrag av ett visst protein till ER Ca 2 + efflux har respektive gen vara effektivt tystas med två olika siRNA (Fig. 1). Dessutom har effekten av att tysta för att övervinnas genom uttryck av respektive vildtyp genen. Vanligtvis använder vi siRNA som är riktad mot kodande och icke-kodande (UTR) region, respektive av genen av intresse. Använda UTR-riktat siRNA ger ett bekvämt sätt för komplettering.
- Seed 5,2 x 10 5 HeLa celler (ATCC nr. CCL-2) i en 6 cm kultur skålen med en 25 mm täckglas (förbehandlats med 200 l av poly-L-lysin (1 mg / ml) för 1 h) i Dulbecco ändrade eagle medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin och inkubera vid 37 ° C i en fuktig miljö med 5% CO 2 (slutliga volymen 3,9 ml).
- Transfektera cellerna med SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, eller en negativ kontroll siRNA med HiPerFect Reagens enligt tillverkarens anvisningar (slutlig koncentration av siRNA: 20 nm). Kortfattat, förbereda siRNA nyligen i en separat mikrocentrifugrör före det egentliga transfektion förfarande: Tillsätt 20 l HiPerFect transfektion reagens till 4 l av varje siRNA (20 M) som är upplöst i 80 ìl OptiMEM. Denna blandning är försiktigt vortexed och inkuberas i rumstemperatur i 10 min. Tillsätt siRNA mix (104 l) droppvis till seedade 5,2 x 10 5 HeLa celler (3,9 ml).
- Efter 24 timmar, ändra medium (3,9 ml) och transfektera cellerna en andra gång med samma siRNA mix (104 l).
- Utvärdera tysta med Western blot-analys. Det bör vara över 80%. Tvätta celler från cellkultur skålen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skörda dem i DMEM. Räkna celler genom att anställa grevinnan Automated celltalsräknare. Lyse cellerna i cell lyseringsbuffert (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mm MgCl 2, 0,5% NP40) kompletteras med ett proteas-hämmare cocktail (3 mikrogram / ml Pepstatin A, 3 mikrogram / ml Leupeptin, 3 mikrogram / ml Antipain, 3 mikrogram / ml Chymastatin) och blanda med SDS-prov buffert (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerol, 5% β-merkaptoetanol, 0,01% bromfenolblått ) för att erhålla en slutlig koncentration av 10,000 celler / mikroliter. Värm prover vid 56 ° C i 15 min och därefter lägga till några glas pärlor och skaka i 20 min till fragment DNA. Separat 20 l av varje prov genom ett Laemmli typ SDS-PAGE (typiskt 15% polyacrylamid för att separera gel). Överför separeras proteiner på en PVDF membran med electroblotting ("wet-blot") vid konstant 400 mA för 3 timmar eller över natten i överföring buffert (100 mm glycin, 12,5 mM Tris-HCl). Efteråt block med 5% (w / v) fettsnål torrmjölk i PBS i 30 min i rumstemperatur och sedan utsätta blot till den primära antikropp riktad mot C-ändstationen av Sec61α från kanin och anti-β-aktin- antikropp från mus. Tvätta blot i PBS-TritonX-100 (0,05%) och TWICE i PBS i 5 min. Visualisera den primära antikroppar med hjälp av ECL Plex get-anti-kanin IgG-Cy5-eller ECL Plex get-anti-mus IgG-Cy3-konjugat och Typhoon-Trio bildsystem i kombination med Image Quant TL mjukvara 7,0. I fallet med SEC61A1 genen är den maximala tysta effekt observeras vanligen 96 timmar efter den första transfektion. En representant experiment visas i figur. 2.
3. Komplettering av HeLa celler
För att rädda fenotyp SEC61A1 tysta, var SEC61A1 cDNA in i flera kloning plats (MCS) av en pCDNA3-intern ribosomala inträde plats (IRES)-GFP-vektor som innehöll cytomegalovirus (CMV) promotor, MCS, den IRES, plus den gröna fluoresecent protein (GFP) kodning sekvens.
- 48 timmar efter den första siRNA transfektion, utbyte på medellång (3,9 ml) en andra gång och omvandla cellerna med antingen tom vektor-eller SEC61A1 uttryck plasmid med Fugene HD enligt tillverkarens protokollet (sista förhållandet vektorn till Fugene HD är 4 mikrogram vektor till 16 l Fugene HD). Kortfattat, förbereda plasmider nyligen i en separat mikrocentrifugrör före omvandlingen förfarande: Tillsätt 16 l Fugene HD omvandling reagens till 4 mikrogram för varje plasmid som är upplöst i 80 ìl OptiMEM. Vortexa försiktigt denna blandning och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. Lägg till plasmiden mix (0,1 ml) droppvis till seedade 5,2 x 10 5 HeLa celler (3,9 ml).
- Efter 48 timmar av plasmid uttryck, med förbehåll kultur rätter att fluorescensmikroskopi före kalcium bildbehandling och skörd. Om nödvändigt byt DMEM av PBS för bättre fluorescens signaler. Rekord fluorescens bilder på ett fluorescensmikroskop utrustat med kylda CCD-kamera. Omvandlingseffektiviteten kan bestämmas genom att dividera antalet celler visar GFP fluorescens av celler räknas i brightfield läge och bör vara över 80%. Ett typiskt resultat visas i figur. 3.
4. Levande cell kalcium imaging
- Före mätning, överföring locket glida belagd med transfekterade HeLa celler i en separat 3,5 cm kultur maträtt. Ladda cellerna med 4 mikroM Fura-2 AM i 1 ml DMEM i 45 minuter vid 25 ° C i mörker 11,12.
- Fäst en 25 slip mm skydd i iMic metall kammaren och tvätta cellerna två gånger och inkubera i en kalcium-buffert (varje gång 300 l).
- Börja samla data om en iMic mikroskop med polykrom V med omväxlande spännande vid 340 nm och 380 nm och mäta den utsända fluorescensen vid 510 nm (Filter set: beamsplitter, 565 nm, emitter, 605/70 nm). Exempel på bilder som innehåller 20-50 celler / ram var 3: s. Rekord Fura-2 signaler som nyckeltal F340/F380, där F340 och F380 motsvarar bakgrunden-korrigerad fluorescensintensitet vid 340 och 380 nm, respektive.
- Efter 1 min, behandla celler med puromycin (500 M) på kalcium-buffert eller med samma buffert. Alternativt behandla celler med en liten molekyl hämmare (t.ex. 10 mikroM trifluoperazine eller 100 mikroM ophibolin A) eller med kalcium utan buffert.
- Efter ratiometrisk mätningar utförs för 2 eller 10 min, lägg thapsigargin (1 M) och fortsätter mätningarna.
- Så småningom cytoslic [Ca 2 +] beräknas från kvoten mätningar av ett etablerat kalibreringsmetod. 2 Analysera data med Excel 2007 och Origin 6,1.
5. Representativa resultat:
Hittills riktar vi frågan om tysta de SEC61A1 genen påverkar kalcium (Ca 2 +) läckage från ER (Fig. 1). Den SEC61A1 genen tystades av två olika siRNA i HeLa celler för 96 timmar. Medan tysta knappast påverkas cellens tillväxt och lönsamhet var protein transport in i ER av halv-permeabilized celler nästan helt inhiberad. Dessutom var SEC61A1 tystade cellerna drabbats hårt i förhållande till Ca 2 + läckage från ER. Effekten av geners uttryck vändes av uttryck av SEC61A1 genen. Således Sec61 komplex som finns i ER membranet av alla kärnförsedda celler bildas Ca 2 + läcka kanaler som kan förväntas spela en avgörande roll i Ca 2 + homeostas. Men förekomsten av stora, vattenfyllda porer med okontrollerad jon permeabilitet, som bildas av Sec61 komplex i ER membranet, allvarligt skulle störa den reglerade frisläppandet av Ca 2 + från ER lumen i cytosolen, en viktig mekanism för intracellulära signalering. Vi identifierade ett calmodulin (CAM) bindande motiv i cytosoliskt N-terminalen av däggdjur Sec61α som band CAM men inte Ca2 +-fri apocalmodulin med nanomolära affinitet och sekvens specificitet. På cellnivå, stimuleras två olika CAM-antagonister Ca
Figur 1. Flödesschema. Se text för detaljer.
Figur 2. Dataanalys för att tysta effektivitet. Tysta utvärderades av västerländsk blot-analys med hjälp av antikroppar som var riktade mot Sec61α och β-aktin (Lastkontroll). Den primära antikroppar visualiseras med hjälp av ECL Plex sekundära antikroppar och fluorescens avbildning.
Figur 3. Dataanalys för transfektion effektivitet. Bilder inspelade på en fluorescensmikroskop utrustat med kylda CCD-kamera. Omvandlingseffektiviteten kan bestämmas genom att dividera antalet celler visar GFP fluorescens av celler räknas i brightfield läge.
Figur 4. Skärmdumpar från levande cell kalcium avbildning av HeLa celler i närvaro av kontroll-eller SEC61A1-siRNA och närvaro eller frånvaro av CAM-antagonist ophiobolin A. HeLa celler behandlades med siRNA mot SEC61A1 (B) eller en negativ kontroll siRNA (A) för 96 h som anges. Dessa celler var lastade med kalcium indikator Fura-2 AM och inkuberas i en Ca 2 + buffert innehållande 0,5 mM EGTA, sedan buffert eller ophiobolin A (Ophio A) i buffert inkom och inkuberingen återupptas. Efter 10 min, + frigöra Ca 2 påbörjades genom att thapsigargin (TG) i frånvaro av yttre Ca 2 + och inkuberingen fortsatte. Skärmdumpar från det kontinuerliga kalcium bildhantering togs på angivna tider.
Figur 5. Dataanalys för live imaging cell kalcium experiment. (A) Kinetic och kvantitativ analys av en serie experiment som visas i figur. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] beräknades från förhållandet mätningar av ett etablerat kalibreringsmetod 2. Effekten av thapsigargin visas som stapeldiagram. (BD) celler behandlades med kontroll siRNA eller den angivna SEC61A1-siRNA för 48 h och därefter omvandlas med antingen kontroll vektor (C), eller SEC61A1 uttryck plasmid (C), eller mutant SEC61A1 uttryck plasmid (D) som anges. Efter 48 timmar var kalcium imaging experiment som genomförs som i figurerna 4 och 5A. Statistisk analys av förändringarna i cytosoliskt Ca 2 + koncentrationen efter tillsats av thapsigargin i experiment som presenteras i en visas är. P värden <0,001 definierades vara viktiga oparade t-test och anges med tre asterisker (***), ns, inte signifikant. Antalet celler som analyserats anges. Genomsnittlig värden anges, felstaplar representerar medelfel av de hjälpmedel (SEM). Vi noterar att dessa exempel var anpassade från ref. 13.
Figur 6. Dessa data visar att frisättningen av begynnande kedjor från Sec61 komplexa verkligen leder till att kalcium ut från ER och bildandet av ett kalcium nanodomain runt cytosoliskt munnen av Sec61 komplex. Detta kalcium är bundet av calmodulin och kalcium-calmodulin stänger Sec61 komplex. "
Discussion
I däggdjursceller spelar endoplasmatiska retiklet (ER) en avgörande roll i protein biogenes liksom i kalcium signalering. Här har vi beskrivit ett experimentellt system som tillåter oss att direkt ta upp rollen som en potentiell Ca 2 + läcka kanal och för att karaktärisera dess förmodade regleringsmekanismer 13. Detta experimentella system som ger oss unika möjligheter att i) utvärdera bidraget från de olika ER membranproteiner till passiva Ca 2 + utflödet från ER i olika celltyper, ii) karakterisera proteiner och mekanismer som begränsar denna passiva Ca 2 + efflux, och iii) studera effekterna av sjukdomen kopplade mutationer i relevanta delar.
Vi noterar att endast livskraftiga celler bör analyseras och att den totala lönsamheten bör vara över 80%. Därför är cellviabiliteten rutinmässigt utvärderas anställa Kärn-ID blå / grön reagens cellviabiliteten enligt tillverkarens protokollet. Vidare statistisk analys av förändringar i cytosoliskt Ca 2 + koncentrationen är obligatoriskt. Därför experimenten måste utföras för fyra olika partier av celler och två täckglas med minst 20 celler måste analyseras för varje tillstånd i ett enda experiment. Vi noterar att de olika experimenten måste utföras på samma tid efter sådd på täckglas.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
SL fick stöd av ett stipendium från DFG (Forskarskolan 845). Detta arbete har finansierats med bidrag från DFG (SFB 530/C1 & FÖR 967) och av HOMFOR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| Penicillin/ Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 | |
| Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| Trifluoperazine | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | ||
| TE2000-S microscopewith DS-5Mc camera | Nikon Instruments | ||
| iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |
References
- Clapham, D. E. Calcium signalling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).
- Van Coppenolle, F. Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores. J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).
- Flourakis, M. Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation. FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).
- Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).
- Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).
- Amer, M. S. Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).
- Tu, H. Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations. Cell. 126, 981-993 (2006).
- Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell. 92, 747-758 (1998).
- Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).
- Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells. J. Immunol. 174, 119-130 (2005).
- Gross, S. A. TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels. J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).
- Erdmann, F. Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. EMBO J. 30, 17-31 (2011).
