Summary
Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.
Abstract
Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine e di calcio di segnalazione 1. Il eterotrimeriche Sec61 complesso nella membrana ER fornisce un percorso di soluzione acquosa di polipeptidi appena sintetizzati nel lume del ER. Recenti lavori di diversi laboratori hanno suggerito che questo complesso eterotrimerico può anche forma transitoria Ca 2 + perdite canali 2-8. L'osservazione chiave di questo concetto era che il rilascio di polipeptidi nascenti dal ribosoma e Sec61 complessi puromicina porta a transitorio rilascio di Ca 2 + dal pronto soccorso. Inoltre, era stato osservato in vitro che al pronto soccorso del lume BiP proteina è coinvolta nella prevenzione della permeabilità agli ioni a livello del Sec61 complesso 9,10. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo del complesso Sec61 come potenziali canali Ca 2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione 11-13. Questo sistema combina mediato silenziamento genico di siRNA e cellule vive Ca 2 + di imaging 13. Le cellule sono trattate con siRNA che sono diretti contro la codifica e la regione non tradotta (UTR), rispettivamente, del gene SEC61A1 o un siRNA di controllo negativo. Nell'analisi di complementazione, le cellule sono co-transfettate con un IRES-GFP vettore che consente l'siRNA resistente espressione del tipo selvatico SEC61A1 gene. Quindi le cellule vengono caricati con il raziometrico Ca 2 +-indicatore FURA-2 di monitorare simultaneamente cambiamenti del Ca 2 + citosolico concentrazione in un numero di cellule tramite un microscopio a fluorescenza. La misurazione continua del citosolico Ca 2 + permette anche la valutazione dell'impatto dei vari agenti, come puromicina, piccole molecole inibitrici, e thapsigargin su Ca 2 + perdite. Questo sistema sperimentale ci dà l'opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti.
Protocol
1. Preparazione delle soluzioni madre
- Preparare calcio senza Buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 mM glucosio in 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)).
- Solubilizzare FURA-2 AM in DMSO per ottenere una soluzione 1 mM magazzino. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è giallo chiaro omogeneo. Proteggere tazza dalla luce. Diluire il FURA-2:00 soluzione madre in 1 ml di Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina ad una concentrazione finale di 4 mM per il carico di cellule HeLa.
- Preparare una soluzione puromicina 12,5 mM magazzino in acqua distillata (pH 7,0). Aliquote conservare a -20 ° C. Diluire la soluzione puromicina 12,5 mM magazzino nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 500 mM puromicina.
- Sciogliere thapsigargin in DMSO per ottenere un 1 Soluzione madre mM.
- Solubilizzare 1 mg ophiobolin A in 20 microlitri cloroformio e, successivamente, mescolare con 25 microlitri di DMSO. La provetta rimane aperta fino al cloroformio è evaporato. Così il finale ophiobolin Una concentrazione è di 100 mm. Aliquote conservare a -20 ° C. Prima dell'uso, diluire soluzioni di riserva nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 100 micron. Quindi, concentrazione finale di DMSO per l'imaging cellulare vivo non supera lo 0,1%.
- Sciogliere trifluoperazina in DMSO ad una concentrazione di 10 mm e aliquote conservare a -20 ° C. Diluire le soluzioni stock in calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 10 mM prima dell'uso. Così la concentrazione di DMSO finale per l'imaging cellulare dal vivo, come per ophiobolin A, non supera lo 0,1%.
- Sciogliere il siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA e siRNA di controllo) in acqua RNase libero di preparare una soluzione stock 20 mM. Mescolare con un vortice e osservare solubilizzazione ad occhio. Conservare aliquote di 50 microlitri a -20 ° C.
2. Silenziamento genico in cellule HeLa
Per studiare il contributo di una certa proteina di ER Ca 2 + efflusso, il gene corrispondente deve essere efficacemente messo a tacere con due diversi siRNA (Fig. 1). Inoltre, l'effetto di silenziamento deve essere superato con l'espressione del gene corrispondente wild-type. Di solito si usa siRNA che sono diretti contro la codifica e non codificanti (UTR) regione, rispettivamente, del gene di interesse. Impiegando UTR-diretto siRNA fornisce un modo conveniente per complementazione.
- Semi di 5,2 x 10 5 cellule HeLa (ATCC no. CCL-2) in un piatto di cultura 6 cm con una scivolata 25 millimetri di copertura (pre-trattati con 200 ml di poli-L-lisina (1 mg / ml) per 1 h) in Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina e incubare a 37 ° C in ambiente umidificato con 5% di CO 2 (volume finale 3,9 ml).
- Trasfezione delle cellule con siRNA SEC61A1, SEC61A1-UTR siRNA, o di un siRNA di controllo negativo utilizzando reagenti HiPerFect secondo le istruzioni del produttore (concentrazione finale di siRNA: 20 Nm). In breve, preparare siRNA fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasfezione reale: aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione HiPerFect a 4 l di ogni siRNA (20 mM) che si dissolve in 80 ml di OptiMEM. Questo mix è leggermente agitazione orizzontale e incubate a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di siRNA (104 microlitri) goccia a goccia per la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml).
- Dopo 24 ore, il cambiamento del mezzo (3,9 ml) e trasfezione le cellule per la seconda volta con la stessa miscela siRNA (104 microlitri).
- Valutare silenziamento mediante analisi Western blot. Dovrebbe essere superiore all'80%. Lavare le cellule dal piatto di coltura cellulare in PBS (PBS) e raccoglierle in DMEM. Contare le cellule utilizzando Automated contatore di cellule contessa. Lisare le cellule in un tampone di lisi cellulare (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) integrato con un inibitore della proteasi cocktail (3 mg / ml pepstatina A, 3 g / leupeptina ml, 3 mg / ml antidolore, 3 g / Chymastatin ml) e mescolare con SDS-campione del buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% β-mercaptoetanolo, 0.01% blu di bromofenolo ) per ottenere una concentrazione finale di 10.000 cellule / ml. Campioni di calore a 56 ° C per 15 minuti e, successivamente, aggiungere alcune perle vetro e vortex per 20 minuti al DNA frammento. Separare 20 l di ciascun campione da un Laemmli tipo SDS-PAGE (tipicamente 15% polyacrylamid per il gel di separazione). Trasferimento delle proteine separate su una membrana PVDF da elettroblotting ("wet-blot") al costante 400 mA per 3 ore o durante la notte in buffer di trasferimento (100 mM Glicina, 12,5 mM Tris-HCl). Successivamente, blocco con il 5% (w / v) di latte magro secco in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi esporre la macchia per l'anticorpo primario diretto contro il C-terminale della Sec61α da coniglio e un anti-β-actina- anticorpi di topo. Lavare la macchia in PBS-TritonX-100 (0,05%) e tWICE in PBS per 5 min, rispettivamente. Visualizza la anticorpi primari utilizzando ECL Plex di capra anti-IgG di coniglio-Cy5 o ECL Plex capra IgG anti-topo-Cy3-coniugato e il Typhoon-Trio sistema di imaging in combinazione con l'Immagine Quant TL software 7.0. Nel caso del gene SEC61A1, l'effetto di silenziamento massima è in genere visto 96 ore dopo la trasfezione prima. Un esperimento rappresentativo è mostrato in fig. 2.
3. Complementazione di cellule HeLa
Al fine di salvare il fenotipo di SEC61A1 tacere, il cDNA SEC61A1 è stato inserito nel sito di clonazione multipla (MCS) di un pcDNA3-sito interno ingresso ribosomiale (IRES)-GFP-vettore che conteneva il citomegalovirus (CMV) promotore, la MCS, l'IRES, più la proteina fluoresecent verde (GFP) sequenza codificante.
- 48 ore dopo la trasfezione di siRNA primo cambio del mezzo (3,9 ml) per la seconda volta e trasformare le cellule sia con vettore vuoto o SEC61A1 plasmide di espressione utilizzando Fugene HD secondo il protocollo del produttore (rapporto finale del vettore per Fugene HD è di 4 mg vettore a 16 microlitri Fugene HD). In breve, preparare plasmidi fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasformazione: Aggiungere 16 microlitri di reagente Fugene trasformazione HD a 4 mg di ogni plasmide, che viene sciolto in 80 ml di OptiMEM. Delicatamente vortice questo mix e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di plasmide (0,1 ml) goccia a goccia la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml).
- Dopo 48 h di plasmide di espressione, piatti della cultura soggetti a microscopia a fluorescenza prima immagine del calcio e la raccolta. Se necessario sostituire DMEM da PBS per una migliore segnali di fluorescenza. Registrare immagini a fluorescenza su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L'efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro e deve essere superiore a 80%. Un risultato tipico è mostrato in fig. 3.
4. Dal vivo delle cellule di imaging del calcio
- Prima della misura, trasferire la polizza di copertura rivestita con cellule HeLa transfettate in un apposito piatto 3,5 centimetri cultura. Caricare le cellule con 4 mM FURA-2 AM in 1 ml DMEM per 45 minuti a 25 ° C al buio 11,12.
- Fissare a 25 vetrino mm nella camera di metallo iMic e lavare le cellule due volte e incubare in un calcio senza buffer (ogni volta 300 ul).
- Iniziare a raccogliere dati su un microscopio iMic con policromi V alternativamente emozionante a 340 nm e 380 nm e la misurazione della fluorescenza emessa a 510 nm (Set di filtri: beamsplitter, 565 nm; emettitore, nm 605/70). Immagini campione contenente 20-50 cellule / fotogramma ogni 3 s. Record FURA-2 segnali come i rapporti F340/F380, dove F340 e F380 corrispondono allo sfondo-sottratto intensità di fluorescenza a 340 nm e 380, rispettivamente.
- Dopo 1 min, il trattamento di cellule con puromicina (500 mM) di calcio senza buffer o con lo stesso buffer. In alternativa, il trattamento di cellule con un inibitore della molecola di piccole dimensioni (come 10 trifluoperazina mM o 100 mM ophibolin A) o con il calcio senza buffer.
- Dopo le misurazioni raziometrico vengono effettuate per 2 o 10 minuti, aggiungere thapsigargin (1 mM) e continuare le misure.
- Alla fine, cytoslic [Ca 2 +] è stimato in base a misure di rapporto con un metodo di taratura. 2 Analizzare i dati da Excel 2007 e Origin 6.1.
5. Rappresentante dei risultati:
Finora abbiamo affrontato la questione se il silenziamento del gene SEC61A1 colpisce calcio (Ca 2 +) di dispersione dal pronto soccorso (Fig. 1). Il gene SEC61A1 è stato messo a tacere da due diversi siRNA in cellule HeLa per 96 ore. Mentre tacere la crescita delle cellule difficilmente colpiti e viabilità, trasporto delle proteine nel ER di semi-permeabilizzate cellule è stata quasi completamente inibita. Inoltre, le cellule SEC61A1 tacere severamente colpite rispetto alla perdita di Ca 2 + dal pronto soccorso. L'effetto di silenziamento genico è stato invertito da espressione del gene SEC61A1. Così, Sec61 complessi che sono presenti nella membrana ER di tutte le cellule nucleate forma Ca + 2 canali di perdita che ci si può aspettare di giocare un ruolo cruciale nella omeostasi Ca 2 +. Tuttavia, la presenza di grandi pori pieni d'acqua con permeabilità agli ioni incontrollata, come formata da Sec61 complessi nella membrana ER, seriamente interferire con il rilascio regolato di Ca 2 + dal lume ER nel citosol, un meccanismo essenziale per intracellulare segnalazione. Abbiamo identificato un (CAM) calmodulina motivo vincolanti in citosolico N-terminale di Sec61α mammiferi che CaM legato ma non Ca 2 + senza apocalmodulin con affinità nanomolare e specificità di sequenza. A livello cellulare, due antagonisti CaM diverse stimolato Ca
Figura 1. Diagramma di flusso. Si veda il testo per i dettagli.
Figura 2. L'analisi dei dati per far tacere l'efficienza. Silenziamento è stata valutata dalla Western-blot utilizzando anticorpi che erano diretti contro Sec61α e β-actina (controllo del carico). Gli anticorpi primari sono stati visualizzati mediante ECL anticorpi Plex secondaria e di imaging di fluorescenza.
Figura 3. L'analisi dei dati per l'efficienza di trasfezione. Le immagini sono state registrate su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L'efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro.
Le schermate Figura 4. Dalle immagini in diretta di calcio di cellule HeLa in presenza di controllo o SEC61A1-siRNA e la presenza o l'assenza del Cam-antagonista ophiobolin A. cellule HeLa sono state trattate con siRNA diretti contro SEC61A1 (B) o un siRNA di controllo negativo (A) per 96 h, come indicato. Queste cellule sono state caricate con l'indicatore di calcio FURA-2 AM e incubate in un buffer di Ca 2 + libero contenente 0,5 mM EGTA, poi buffer o ophiobolin A (Ophio A) in tampone è stato aggiunto e l'incubazione ripreso. Dopo 10 min, Ca 2 + rilascio è stato avviato applicando thapsigargin (TG) in assenza di esterni Ca 2 + e l'incubazione è stato continuato. Schermate dalle immagini di calcio continuo sono state prese nei tempi indicati.
Figura 5. L'analisi dei dati per gli esperimenti dal vivo delle cellule di calcio di imaging. (A) Analisi cinetica e quantitativa di una serie di esperimenti come rappresentato nella fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] è stato stimato dalle misure rapporto con un metodo di taratura 2. L'effetto di thapsigargin viene visualizzato come grafico a barre. (BD) Le cellule sono state trattate con siRNA di controllo o il indicate SEC61A1-siRNA per 48 ore e poi trasformato sia con controllo vettoriale (C), o SEC61A1 plasmide di espressione (C), o mutante SEC61A1 plasmide di espressione (D) come indicato. Dopo 48 ore, gli esperimenti di imaging del calcio sono stati effettuati come nelle figure 4 e 5A. L'analisi statistica delle variazioni del Ca 2 + citosolico concentrazione dopo l'aggiunta di thapsigargin in esperimenti come presentati in A sono mostrati. Valori di p <0.001 sono stati definiti come significativi da spaiati t test e sono contrassegnati con tre asterischi (***), ns, non significativo. Il numero di cellule che sono state analizzate sono indicati. I valori medi sono dati, le barre di errore rappresentano gli errori standard dei mezzi (sem). Prendiamo atto che questi esempi sono stati adattati da rif. 13.
Figura 6. Questi dati indicano che il rilascio di catene nascenti dal complesso Sec61 porta infatti a rilasciare calcio dal ER e la formazione di un nanodomain calcio intorno alla bocca citosolica del complesso Sec61. Questo calcio è vincolato da calmodulina e calcio-calmodulina chiude il Sec61 complesso ".
Discussion
Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi delle proteine come pure nella segnalazione di calcio. Qui, abbiamo descritto un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo di un potenziale canale di Ca 2 + perdite e per la caratterizzazione dei meccanismi putativi normativo 13. Questo sistema sperimentale ci dà l'opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti.
Prendiamo atto che solo le cellule vitali dovrebbero essere analizzati e che la vitalità complessiva deve essere superiore a 80%. Pertanto, la vitalità cellulare è regolarmente valutato impiegando nucleare-ID blu / verde reagente vitalità cellulare secondo il protocollo del produttore. Inoltre, l'analisi statistica delle variazioni di concentrazione citosolica Ca 2 + è obbligatoria. Pertanto, gli esperimenti devono essere effettuati per quattro diversi lotti di cellule e due coprioggetto con almeno 20 cellule devono essere analizzati per ogni condizione in un singolo esperimento. Prendiamo atto che i vari esperimenti devono essere effettuati allo stesso tempo dopo la semina sul coprioggetto.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
SL è stato sostenuto da una borsa di studio dalla DFG (Scuola di Dottorato di Ricerca 845). Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della DFG (SFB 530/C1 & PER 967) e da HOMFOR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| Penicillin/ Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 | |
| Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| Trifluoperazine | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | ||
| TE2000-S microscopewith DS-5Mc camera | Nikon Instruments | ||
| iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |
References
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