مختبر تقنيات العقيم: التحويلات الحجم مع الماصات المصلية وMicropipettors

Summary

عند العمل في المختبر، لا بد من الحد من مصادر التلوث. تقنية العقيم يشير إلى الإجراءات التي تسمح لنقل الثقافات والكواشف مع تجنب الاتصال مع المنظمات غير معقمة السطوح. وتستخدم ماصات المصلية وmicropipettors لقياس كميات الدقيق دون المساس عقم الحلول المستخدمة في التجارب.

Abstract

الكائنات الحية الدقيقة في كل مكان - في الهواء والتربة، وجسم الإنسان وكذلك على الأسطح غير حية مثل المقاعد ومختبر لوحة مفاتيح الحاسوب. في كل مكان من الميكروبات يخلق امدادات وفيرة من الملوثات المحتملة في المختبر. لضمان نجاح التجربة، يجب أن يكون الحد الأدنى لعدد من الملوثات على الأسطح والمعدات والعمل. المشترك بين العديد من التجارب في علم الأحياء المجهرية من التقنيات التي تنطوي على قياس ونقل الثقافات التي تحتوي على الخلايا البكتيرية أو الجسيمات الفيروسية. للقيام بذلك من دون الاتصال غير معقمة أو الأسطح الملوثة وسائل الاعلام عقيمة يتطلب (1) إعداد مساحة عمل عقيم، (2) تحدد بدقة وقراءة بدقة الأدوات اللازمة لنقل العقيم من السوائل، و (3) معالجة بشكل صحيح من الصكوك والثقافات قوارير وزجاجات و أنابيب داخل حقل معقمة. تعلم هذه الإجراءات تدعو إلى تدريب وممارسة. في البداية، وينبغي اتخاذ إجراءات قد تكون بطيئة، مدروسة، والتي تسيطر عليها مع هدف يجري لتي العقيمechnique لتصبح طبيعة ثانية عند العمل على مقاعد البدلاء. هنا نقدم خطوات لقياس حجم استخدام ماصات المصلية وmicropipettors داخل حقل العقيمة التي أنشأتها ناسخ بنسن. أحجام تتراوح ما بين microliters (ميكرولتر) إلى ملليلتر (مل) اعتمادا على الأداة المستخدمة. نقل السوائل عادة تشمل حساء عقيم أو المحاليل الكيميائية، وكذلك الثقافات البكتيرية وأسهم فج. باتباع هذه الإجراءات، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:

• العمل في مجال العقيمة التي أنشأتها لهب الموقد بنسن.
• استخدام ماصات المصلية دون المساس عقم الصك.
• نضح السوائل مع ماصات المصلية، والقراءة على وجه التحديد كميات معايرة عن طريق محاذاة الغضروف المفصلي التي شكلها السائل إلى علامات التخرج على ماصة.
• الحفاظ على الزجاجات والثقافة، وقوارير وأنابيب وقبعات كل منهما معقم خلال نقل السائل.
• التعرف على التطبيقات المختلفة لبيب المصلية البلاستيك مقابل زجاجettes.
• قيود دقة الدولة للmicropipettors.
• على وجه التحديد وبدقة وضع وحدات التخزين على micropipettors.
• معرفة كيفية استخدام صحيح المحطة الأولى والثانية على micropipettor إلى نضح ونقل وحدات التخزين الصحيح.

Protocol

1. إعداد مساحة عمل عقيم

1. قبل البدء في أي إجراءات التعقيم في مجال عملك، ويجب غسل اليدين جيدا بالماء والصابون المطهر والماء الدافئ.
   • تأكد من إعادة غسل اليدين في أي وقت كنت تشك لديك تلوث من التلاعب بك التجريبية.
2. ازالة جميع المواد التبعثر مجال عملك على مقاعد البدلاء المختبر. إزالة ما قبل مبلل مطهر مسح من العلبة والقضاء عليها في المنطقة بأسرها. السماح للمطهر لتتبخر - لا يمسح الجاف!
   • استخدام المطهرات مثل الكحول (الأيزوبروبانول أو الايثانول 70 في المائة) أو مركبات الفينول (O-phenylphenol).
   • للحيلولة دون هباء، أو إنتاج رذاذ خفيف يحتوي على الخلايا البكتيرية، وانتشار الملوثات الميكروبية، وتجنب الاستغناء مطهر من زجاجة أزمة.
   • تجفيف من الكائنات الحية الدقيقة هي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتطهير الأسطح.
   • حتى لو كان شخص ما قد استخدمت في الآونة الأخيرة على مقاعد البدلاء المختبر وجرى محو أعلى إلى أسفل مقعد مع مطهر، تبدأ دائما من وقتك مختبر مسح أسفل المقعد.
3. بعد مطهر قد جفت تماما، استخدام أنبوب لتضيء الموقد بنسن. ضبط الشعلة بحيث يمكن رؤية مخروط أزرق في وسط اللهب. الشعلة تنتج الآن إلى التيار الصاعد، أو تيارات الحمل الهواء في الجو الحار الذي ترتفع وبعيدا عن اللهب (الشكل 1). مع ارتفاع الحرارة، وتضطر الكائنات الدقيقة وذرات الغبار إلى أعلى، وبعيدا عن منطقة العمل على الفور. يعمل ببطء، بعناية، وبشكل متعمد في جميع الأوقات في هذا المجال التي أنشأتها الموقد بنسن، ويشار إلى حقل معقمة. الحفاظ على موقد بنسن في أثناء العملية بأكملها.
   • غيض من مخروط أزرق هو الجزء الاكثر حرارة من اللهب.
   • يجب الحرص على عدم تعكير صفو التيار الصاعد من قبل الحركات السريعة أن يحدث تغييرا هائلا في منظمة العفو الدوليةالتيارات ص حول مقاعد البدلاء المختبر. تهيئة التيار الصاعد مع الموقد بنسن يقلل من إمكانية الكائنات الحية الدقيقة والغبار التي تقع على مقاعد البدلاء أو في زجاجات مفتوحة، وأنابيب أو قوارير في مجال العمل.
4. ترتيب جميع المستلزمات اللازمة لإجراء على مقاعد البدلاء المختبر بالقرب من حقل معقمة. تأكد من وصفت بشكل صحيح جميع المواد.
   • وقد اشتملت هذه المساعدات على الماصات المصلية وmicropipettors، وأنابيب ثقافة عقيمة، وقوارير معقمة، وزجاجات تحتوي على سائل الاعلام مرق، وأنابيب microcentrifuge عقيم، نصائح micropipettor، ورفوف للأنابيب، والثقافات الخلية البكتيرية، والأرصدة فج.
   • ويجب تعقيم وسائل الإعلام السائلة في الأوتوكلاف درجة مئوية في 121 ل15 دقيقة على الأقل على الإعداد السائل. كميات أكبر من وسائل الاعلام (> 1L) تتطلب أوقات أطول الأوتوكلاف. ويجب تعقيم المختبرات الطبية في الأوتوكلاف درجة مئوية في 121 ل30 دقيقة على الأقل على الجاذبية (الجاف) الإعداد.
   • بشكل عام، قد يتم تخزين الحلول العقيمة عند 4درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أشهر. لاحظ أن يتم خفض كثيرا من الوقت لإيجاد حلول التخزين التي تحتوي على مكونات غير مستقر مثل المضادات الحيوية - دائما التحقق من توصيات الشركة الصانعة.

2. نقل السوائل عن طريق الماصات المصلية

1. ماصات المصلية تأتي في أحجام عديدة وخيارات: البلاستيك أو الزجاج، ويمكن التخلص منها أو القابلة لإعادة الاستخدام، صوم أو موصول. ومعايرة هذه لتسليم وحدات التخزين التي تتراوح بين 0،1 حتي 25 مل مل.
   • أحجام مشتركة لماصات المصلية هي 5 مل، 10 مل و 25 مل، وينبغي أن تستخدم لنقل السوائل المعقمة من 0.1 مل أو أكثر (لوحة ألف من الشكل 2). وهناك أيضا الماصات أكبر المصلية التي يمكن ان تنقل ما يصل الى حجم 100 مل، إلا أن التركيز من هذا البروتوكول هو على الماصات أكثر شيوعا، أصغر حجما.
   • وهناك حاجة مسبقا تعقيم الماصات مع القطن والصوف المكونات لعلم الأحياء المجهرية وتجارب زراعة الأنسجة. لا ينبغي أن المكونات يمكن إزالته من علىف من ماصة؛ أنها مصممة لتعمل كحاجز أمام الملئ ماصة.
   • تطبيقات مختلفة تستدعي الماصات البلاستيكية مقابل زجاج المصلية. وهناك حاجة للزجاج المذيبات العضوية. ويمكن استخدام إما عند تنفيذ BSL-1 تجارب على مختبر أعلى مقاعد البدلاء. ويمكن استخدام البلاستيك فقط عند العمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع BSL-2 الكائنات الحية التي لا يمكن فيها ناسخ بنسن استخدامها. كما أنه من المستحسن أن يتم استخدام البلاستيك للتطبيقات التي تنطوي على نقل أجار المنصهر.
   • ماصات المصلية هي من نوعين: TC ("لاحتواء") أو TD ("لتقديم"). ماصات TC تقديم كل وحدة التخزين، بما في ذلك معلومات سرية، ويجب أن "تطاير" أو تشطف للحصول على حجم معين. يتم معايرة الماصة TD ترك القليل في الطرف الذي لا ينبغي أن يتم تسليمها. مما لا شك فيه للتحقق من الملصق على جثة بالقرب من أعلى ماصة للتأكد من أي نوع كان (الشكل 3). الأكثر شيوعا هي ماصات TD، والتي هي مارسرطة مع حلقات مزدوجة في القمة.
2. اتخاذ ماصة بلاستيكية معقمة المصلية (وتسمى أيضا ماصة نقل الحجمي)، وإزالة بعناية كم ورقة في نهاية مع القطن والصوف المكونات بواسطة تقشير بعيدا مثل الجلد من الموز - لا تقم بإزالة كم كامل، وحماية رأس ماصة التي سوف تأتي في اتصال مع وسائل نقلها. تلمس فقط الجزء العلوي من ماصة (فوق علامات التخرج) بيديك.
   • لم يذهب الى حل عقيم مع ماصة المستخدمة، وحتى لو كان هناك حرص كبير للحفاظ على العقيمة.
   • عادة يتم تخزين الماصات الزجاجية المصلية في علب معدنية (لوحة (ب) من الشكل 2). تخفيف الجزء العلوي من العلبة ثم إزالة الغطاء بعناية، ولهب نهايات مفتوحة للقبعة وعلبة. وضع سقف لأسفل، وعلى جانبها، على مقاعد البدلاء تطهيرها. إزالة أحد ماصة من العلبة من خلال عقد أفقيا وتهتز برفق حتى قمم واحد أو اثنين الماصةقسم التدريب والامتحانات التمسك بها عن شبر واحد، ويمكن أن تستوعب بسهولة. وضع العلبة في جانبها وإزالة أحد ماصة، ولكن الحرص على عدم لمس الماصات الأخرى في الحاوية. لا تلمس طرف السفلي من ماصة بيديك، وتجنب الاتصال من طرف مع الأسطح غير معقمة أخرى.
3. اللاحقه من المساعدات ماصة مثل لمبة، ومضخة، أو بندقية إلى نهاية العلوي من ماصة المصلية. إزالة كم ورقة من ماصة بلاستيكية. الاستمرار على مساعدات ماصة في يدك اليمنى.
   • إذا باستخدام ماصة الزجاج، وتمرير الثلث الاخير من ماصة من خلال مخروط الزرقاء في لهب الموقد بنسن ثوان 1-3. استدارة 180 درجة ماصة لأنها تمر عبر اللهب. لا يمكن أن الماصات البلاستيكية وأنابيب يمكن ملتهب.
   • إذا أعسر، عقد المعونة ماصة في يدك اليسرى وإجراء المناورات لاحق من الزجاجات والثقافة، وأنابيب بيدك اليمنى.
   • تلوث يميل إلى أن يحدث مع ماصات من البلاستيك عندما سحب خفيفة النهائي[هس من ماصة من الأكمام، لأن الطرف عقيم يأتي في اتصال مع جزء من كم تأثرت يديك.
4. إزالة الغطاء من زجاجة تحتوي على سائل الاعلام عقيمة. لا تضع غطاء على مقاعد البدلاء المختبر ولكن لأنه عقد بين البنصر الخاص بك، وراحة اليد اليمنى في حين التلاعب في المساعدات ماصة مع الإبهام، مؤشر وأصابع الوسطى من نفس اليد (الشكل 4). عقد زجاجة بزاوية 45 درجة، وتمرير حافة الزجاجة من خلال شعلة الموقد بنسن، وخلق مجال عقيم حول زجاجة مفتوحة.
   • على الرغم من الأفضل تجنبها، إذا كان يجب وضع الغطاء إلى أسفل، وضعه مواجهة على سطح تطهيرها. مع قبعة أن ينبري، وهناك فرصة أكبر للتلوث من تحركات الكائنات أو اليدين، وخلق تيارات الهواء التي تسبب الكائنات المجهرية وجزيئات الغبار أن ينزل إلى السطح الداخلي للغطاء.
   • الغرض من الغضب ليس لتعقيم لكن لتدفئة يا فتحو في زجاجة، وخلق تيارات الحمل الهواء وحتى بعيدا من فتح (أي التيار الصاعد). الدافئة، والهواء ارتفاع يساعد على منع ذرات الغبار وغيرها من الملوثات من دخول زجاجة.
   • الحفاظ على حاوية معقمة مفتوحة لأقل وقت ممكن. من المهم الحفاظ على نقاط الدخول من الكائنات الحية الدقيقة المحمولة جوا إلى أدنى حد ممكن في جميع أنحاء الداخلي.
   • تجنب السعال والعطس، والحديث، وحركة غير مقصودة أخرى في حين حاويات معقمة مفتوحة.
   • أبدا تمرير اليدين والأصابع على الجزء العلوي من حقل معقمة (أي وزجاجات أو قوارير مفتوحة، داخل الأنابيب وقبعات زجاجة) بمجرد مرورهم على لهب الموقد بنسن.
   • دائما العمل مع لهب مكشوف عند فتح أنابيب معقمة أو الزجاجات. أبدا لديها أكثر من أنبوب واحد، وزجاجة، أو القارورة مفتوحة على مقاعد البدلاء في وقت واحد. وينبغي أن يتم المشتعلة فور الافتتاح وقبل الزجاجات والأنابيب وإغلاق القوارير.
5. وضع غيض من serolماصة ogical في زجاجة تحتوي على سائل الاعلام عقيمة ثم نضح، أو رسم نموذج جو معقم و مطهر، من الزجاجة. استخدام المساعدات ماصة للسيطرة على تدفق من العينة إلى ماصة. قراءة بالضبط حجم الانتباه الى ماصة عن طريق محاذاة الغضروف المفصلي التي شكلت في أعلى العمود السائل إلى علامات التخرج على ماصة معايرة (الشكل 5).
   • لا الفم الماصة! دائما استخدام المساعدات الماصة (المضخة، لمبة، أو بندقية).
   • إيلاء الاهتمام لسلسلة من الأرقام عند تحديد حجم يستنشق. ويمكن طباعة أعداد تلميح لالعكس أعلى، أو العكس، أو كثير من الأحيان في كلا الاتجاهين.
   • عند قراءة وحدة التخزين، عقد دائما عموديا ماصة، عمودي على الأرض، والاطلاع على الغضروف المفصلي سائل ميتا على مستوى العين.
   • ماصات المصلية ليست سوى دقيقة مثل زيادة أصغر ملحوظ، وهو عادة 0.1 مل لمدة 5 مل و 10 مل الماصات و 0.2 مل لماصات 25 مل. أناهناك حاجة إلى مزيد من الدقة و قد يتم استخدام ماصة المصلية في توليفة مع micropipettor.
6. تمرير حافة الزجاجة من خلال لهب الموقد بنسن مرة أخرى، ثم ضع الغطاء على ظهر الزجاجة. ضبط زجاجة وسائل الإعلام جانبا.
   • لا تحرق نفسك مع الموقد بنسن في الاندفاع لإغلاق زجاجة.
7. عقد أنبوب اختبار أو قارورة في يدك اليسرى. وعقد إزالة الغطاء كما هو موضح في الخطوة رقم 4 أعلاه. إنشاء حقل معقم بواسطة لهب حافة أنبوب أو قارورة في الموقد بنسن.
8. الاستغناء عن وسائل الإعلام في ماصة في أنبوب أو قارورة. السيطرة على تدفق العينة بحيث أنه لا ينفق من الأنبوب أو قارورة.
   • ويمكن قياس مثل هذه الكميات التي يتم تسليم وحدة التخزين بالكامل، وماصة المصارف تماما، أو يتم التوصل إلى حجم معين عن طريق القيام تسليم من نقطة إلى نقطة (مجلد واحد وسم إلى آخر).
9. تمرير حافة أنبوب أو قارورة من خلال حرق بنسنإيه لهب مرة أخرى، ثم استبدل الغطاء. تعيين أنبوب أو قارورة جانبا. إزالة مساعدات ماصة، وتجاهل ماصة في وعاء النفايات السليم.
   • ماصات المصلية البلاستيك يتم التخلص منها، في حين يمكن تعقيم الزجاج الماصات المصلية واستخدامها مرة أخرى. التخلص السليم يتطلب أن توضع الماصات البلاستيكية في حاوية الأدوات الحادة المعينة (مربع جامدة تصطف مع كيس من البلاستيك التخلص)، في حين الماصات الزجاجية في البداية يجب أن تكون مغمورة في وعاء مع حل التبييض 10٪ لتطهير الأسطح في الداخل والخارج. فينبغي على الماصات الزجاجية تغسل جيدا مع منظف مختبر، تشطف بالماء المقطر، وتعقيمها في الأوتوكلاف.
10. وينبغي اتباع هذه الخطوات نفسها عندما تحصين وسائل الاعلام مع ثقافة جرثومية أو الأوراق المالية بالعاثية أو عند تنفيذ التخفيفات المسلسل.

3. نقل السوائل عن طريق Micropipettors

1. ويمكن قياس بدقة والاستغناء مجلدات دقيقة تكون إملاءتسليط باستخدام micropipettors (كما يشار إلى Pipetman؛ لوحة ألف من الشكل 6). هذه الصكوك تأتي في أحجام مختلفة مع كل مجموعة وحجم معين: P2 ل0،2-2 ميكرولتر، P10 لميكرولتر 1-10، 2-20 P20 لميكرولتر، P200 ل20-200 ميكرولتر، وP1000 ل200-1000 ميكرولتر.
   • علاج micropipettors مع الرعاية، لأنها هي أجهزة دقيقة. لا تترك لهم الكذب على مقاعد البدلاء المختبر غير مراقب حيث يمكن القاضية لهما من وألحق أضرارا. لا تسمح الماصات لتتلامس مع المواد الكيميائية المسببة للتآكل.
   • لكميات أكبر من 1000 ميكرولتر، واستخدام ماصة المصلية.
   • على الرغم من أن تعمل في مجال العقيمة التي أنشأتها الموقد بنسن، لا micropipettors لهب، والأنابيب البلاستيكية ونصائح. وينبغي للأنابيب ونصائح مسبقا تعقيمها. ويمكن محو micropipettors بمطهر قبل مبلل مسح قبل استخدامها.
2. يمكن تعيين volumeter رقمية تظهر حجم الاستغناء عن طريق تحويل مقبض التعديل. Adjusتي حجم قبل الانتقال إلى الخطوة رقم 3.
   • NEVER أدر مفتاح التكيف فوق النطاق المراد!
   • للحصول على أقصى قدر من الدقة عندما خفض حجم الإعداد على micropipettor، اطلب ببطء عجلة الإبهام، والتأكد من عدم التجاوز على علامة التخرج.
   • للحصول على أقصى قدر من الدقة عند زيادة حجم الإعداد على micropipettor، اطلب عجلة الإبهام يصل، ويمر علامة التخرج المطلوبة من قبل 3/1 المؤرخ منعطفا. ثم طلب ببطء عجلة الإبهام للوصول الى حجم المقصود، والتأكد من عدم التجاوز على علامة التخرج.

   وvolumeter يظهر ثلاثة أرقام. اعتمادا على micropipettor، يتم تفسير الأرقام بشكل مختلف. لاحظ أن كل micropipettor ليست سوى دقيقة مثل علامة أصغر التخرج.

   P2: للحصول على وحدات التخزين بين 0،2-2،0 ميكرولتر. الرقم الأعلى يدل على وحدة التخزين في microliters. وindicat الرقم الثانيأعشار من وفاق ميكروليتر (0.1 ميكرولتر)، والرقم الثالث يمثل المئات من ميكروليتر (0.01 ميكرولتر). كل علامة التخرج يساوي زيادة قدرها 2/1000 واحد (0.002 ميكرولتر) من ميكروليتر.

   P10: للحصول على وحدات التخزين بين 1،0-10،0 ميكرولتر. الرقم الأعلى هو لعشرات microliters، وهذا عادة ما يتم تعيين في "0" ويجب ألا يتم تعيين في "1" مع الرقمين الآخرين وضعت في "0" عندما الاستغناء 10.0 ميكرولتر. الرقم الأوسط يدل على وحدة التخزين في microliters. الرقم الثالث يشير إلى أعشار من ميكروليتر (0.1 ميكرولتر). كل علامة التخرج يساوي زيادة قدرها 2/100 واحد (0.02 ميكرولتر) من ميكروليتر.

   P20: للحصول على وحدات التخزين بين 2،0-20،0 ميكرولتر. الرقم الأعلى في الأسود لعشرات microliters، وينبغي أن تحدد هذه فقط في "2" مع الرقمين الآخرين وضعت في "0" عندما الاستغناء 20.0 ميكرولتر. الرقم الثاني في أسود يدل على وحدة التخزين في microliters. الرقم الثالث في أحمر يشير إلى 10تي إتش إس لميكروليتر (0.1 ميكرولتر). كل علامة التخرج يساوي زيادة قدرها 2/100 واحد (0.02 ميكرولتر) من ميكروليتر.

   P200: للحصول على وحدات التخزين بين 20،0-200 ميكرولتر. الرقم الأعلى هو لمئات من microliters، وينبغي أن تحدد هذه فقط في "2" مع الرقمين الآخرين وضعت في "0" عندما الاستغناء عن 200 ميكروليتر. الرقم الأوسط يدل على حجم الاستغناء في عشرات microliters، والرقم الثالث يدل على وحدة التخزين في microliters. كل علامة التخرج يساوي زيادة قدرها 2/10 واحد (0.2 ميكرولتر) من ميكروليتر.

   P1000: للحصول على وحدات التخزين بين 200-1000 ميكرولتر. الرقم الأعلى هو لآلاف microliters، وهذا عادة ما يتم تعيين على "0" ويجب ألا يتم تعيين في "1" مع الرقمين الأخرى الواردة في "0" عندما الاستغناء عن 1000 ميكرولتر. العدد الأوسط هو لمئات من microliters. الرقم السفلي هو لعشرات microliters. كل علامة التخرج يساوي زيادة قدرها microliters (2 ميكرولتر) 2.

   • أداء تحقق: يجب معايرة هذه الصكوك سنويا، وضمان الدقة والإحكام تمسك بالبقاء ضمن ± 5٪ من المواصفات. استخدام مقياس تحليلي لقياس المياه، والتأكد من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى لتتوافق مع حجم المقصود. على سبيل المثال، تستخدم لنقل P1000 200 ميكروليتر من الماء لوزن طبق على نطاق واسع. منذ المياه لديها كثافة من 1، ثم 1 مل من الماء ما يعادل 1 غرام (ز). وبالتالي، يجب أن 200 ميكروليتر (0.2 مل) من الماء يكون مساويا إلى 0.2 غرام. أيضا، تأكد من أن معلومات سرية لا يمكن للتسرب والحفاظ على وحدة التخزين المطلوب حتى الاستغناء عن استخدام نظام الغطاس.
3. يجب أن تستخدم Micropipettors مع نصائح البلاستيك القابل للتصرف في جميع الأوقات. تناسب طرف بإحكام على نهاية برميل من micropipettor. اضغط لأسفل وتحريف طفيف لضمان وجود الختم محكم.
   • وتكتظ عادة نصائح في صناديق من البلاستيك والتي يمكن تعقيمها بواسطة جهاز الأوتوكليف. فتح مربع طرف لاسترداد رأس، ثم أغلق مربع طرف للحد من اتصال مع الملوثات في الهواء.
   • بعض النصائح لديك مرشحات مماثلة لشمعات القطن والصوف على الماصات المصلية. هذه النصائح وغالبا ما تكون اكثر كلفة من نصائح العادية، وبالتالي تستخدم في تطبيقات متخصصة. على سبيل المثال، عند قياس المواد الكيميائية المتطايرة مثل الكلوروفورم أو السوائل المشعة مثل الحمض النووي المسمى ف ^32، وذلك باستخدام نصائح فلتر يساعد على منع برميل من micropipettor من الحصول على الملوثة.
4. عقد micropipettor في وضع عمودي.
   • الحفاظ على micropipettor سيمنع تستقيم السوائل من تشغيل داخل وتلويث برميل من micropipettor.
5. وmicropipettor ثلاث وظائف: (1) موقف الراحة، (2) اول محطة، و (3) المحطة الثانية (الشكل 6، لوحة B). الصك لديها نظام الغطاس التوقف مرتين. المحطة الأولى وظيفتين. الأول هو أن ألفت في حجم المطلوب من السائل إلى عرج غيضن الافراج عن الغطاس من المحطة الأولى لموقف بقية. وتتمثل المهمة الثانية في صرف معظم السائل من طرف عندما تضغط على المكبس من موقف بقية إلى المحطة الأولى. الاكتئاب مزيد من المكبس إلى الاستغناء المحطة الثانية أيا كان السائل لا يزال في الطرف.
   كساد الضغط على زر وعلى الغواص من موقف بقية إلى المحطة الأولى. وسيتم تشريد الهواء يساوي حجم الإعداد.
6. تزج طرف في السائل أثناء الضغط باستمرار على الضغط على زر وإلى المحطة الأولى.
   • لا تلمس micropipettor نفسها على جانبي الأنابيب والزجاجات والقوارير، وإلا سوف تصبح ملوثة السطوح داخل هذه السفن. فقط النصائح هي عقيمة.
7. الافراج عن الضغط على زر وببطء إلى نضح السائل إلى الحافة. توقف مرة واحدة في الضغط على زر وعاد الى موقف بقية. انتظر لحظة حتى يمكن استخلاص السائل إلى الحافة.
   • فإن حجم السائل في الطرف يساوي حجم سو الإعداد للmicropipettor.
   • سوائل لزجة مثل تلك التي تحتوي على الجلسرين تتطلب المزيد من الوقت لدخول طرف.
8. إزالة غيض من السائل، وفحص البصر طرف للتأكد من أن السائل وضعت وصلت الى المستوى المتوقع في الطرف وليس هناك أي فقاعات الهواء في الطرف.
   • إذا لزم الأمر، طرد السائل يدويا وتشديد على نصائح وmicropipettor. وضع السائل والتحقق مرة أخرى.
9. ضع طرف بزاوية (10 درجة الى 45 درجة مئوية) ضد جدار أنبوب تلقي السائل. لطرد السائل، وخفض ببطء عبر الضغط على زر في المكبس إلى المحطة الأولى. انتظر لحظة ثم اضغط على الضغط على زر وإلى المحطة الثانية لطرد أي السائل المتبقي في الطرف.
   • قد تضغط على المكبس بسرعة كبيرة جدا تسبب طرد السائل إلى ترشيش أو إنتاج وفقاعات غير مرغوب فيه في الأنبوب.
10. قبل الافراج عن الغطاس لموقف بقية، وإعادةتحرك غيض من السائل.
11. تجاهل نصائح معينة في حاوية نفايات الأدوات الحادة عن طريق الضغط على زر طرد على micropipettor.

4. تنظيف مساحة العمل

1. عند الانتهاء من التجربة التي تتطلب استخدام تقنية العقيم، إيقاف الموقد بنسن، ثم وضعت بعيدا عن الإمدادات والكواشف. مسح أسفل الأسطح خارج المختبرات الطبية (الزجاجات، micropipettors، ماصة صناديق TIP) بمطهر قبل مبلل مسح لضمان عدم نقل الملوثات إلى موقع التخزين.
2. مكان ملوث والأواني الزجاجية ومواد النفايات الخطرة في وعاء التخلص السليم. النفايات ويشمل هذا المختبر المختبرات الطبية مثل القفازات، والماصات، نصائح، وأنابيب. يتم إنشاء غير المعدية النفايات الخطرة عند إجراء التجارب مع المنظمات غير المسببة للأمراض الكائنات (BSL-1) في حين يتم توليد النفايات الخطرة المعدية عند استخدام الكائنات المسببة للأمراض (BSL-2 أو أعلى). يجب أن تكون النفايات المعدية قبل احتساب مشبع أو تطهيرهاه يتم تجاهلها. يتبع المبادئ التوجيهية سلامة المختبرات وصفها في BMBL (5 ^عشر إد.)، فضلا عن تلك التي توفرها الصحة البيئية OSHA والمؤسسية والإدارات السلامة.
3. مسح أسفل منطقة العمل بالكامل على مقاعد البدلاء المختبر مع ما قبل مبلل مطهر مسح من العلبة، مرة أخرى، مما يتيح للمطهر لتتبخر.
4. غسل اليدين جيدا بالماء والصابون المطهر والماء الدافئ قبل مغادرة المختبر.

5. ممثل النتائج

ويظهر تطبيق نموذج لاستخدام ماصات المصلية لنقل السوائل في الشكل 7. هذه الماصات كثيرا ما تستخدم في مختبر علم الأحياء المجهرية لإعداد وسائل الاعلام للتلقيح مع الثقافات البكتيرية. على سبيل المثال، قوارير معقمة 1 تمتلئ مع حجم محدد من حساء الثقافة، في هذه الحالة لوريا حساء (LB)، ثم يتم إضافة عدد قليل من الخلايا (مثل كولاي) الى وسائل الاعلام. باستخدام ص المصليةipette، لا بد أولا من ومرق نقل جو معقم و مطهر من الزجاجة وسائل الإعلام إلى القارورة. في هذه الحالة، تم إضافة 25 مل من LB إلى قارورة معقمة 125 مل باستخدام ماصة 25 مل المصلية. المقبل، لا بد من تحصين ومرق مع E. كولاي الخلايا. هنا، تم نقل 10 ميكروليتر من الخلايا جو معقم و مطهر باستخدام micropipettor P20 من دورق ثقافة متنامية من قبل إلى 25 مل من LB الطازجة. يتم تحضين القارورة في غرفة نمو لفترة معينة من الوقت، مما يسمح للخلايا لتكرار (في هذا المثال، تم تحضين الخلايا كولاي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في منصة اهتزاز). والنتيجة هي عكر ثقافة الخلية البكتيرية التي يمكن استخدامها لاجراء تجارب لاحقة.

ماصات المصلية أيضا يمكن أن تستخدم لنقل وسائل الإعلام المتوفرة أصلا في زجاجة إلى أنابيب الاختبار، أو بين أنابيب الاختبار، كما هو الحال عند إجراء التخفيفات ثقافة البكتيرية. إذا لم يتم الحفاظ على تقنية العقيم طوال هذه الأنواع من التلاعب وسائل الاعلام ، ثم الثقافات سوف تصبح ملوثة، وسيتم تأجيل تجارب لاحقة باستخدام هذه الثقافات لأن الطازجة، والثقافات غير الملوثة وسوف تحتاج إلى أن تكون مستعدة. تحدث أخطاء لأنه لم يتم الحفاظ على مجال معقم طوال الإجراء. على سبيل المثال، قد ننسى لتطهير مقاعد البدلاء المختبر أو لهب حافة زجاجة ثقافة أو أنبوب. قد كنت على اتصال غيض من ماصة أو تعيين الحد الأقصى من زجاجة أو أنبوب اختبار على مقاعد البدلاء بدلا من عقده في يدك. الإجراء السليم هو أمر حاسم لحفظ تلوث من وسائل الإعلام والثقافات إلى الحد الأدنى. الشكل 8A مثالا لثقافة نقية مقابل الملوثة من E. القولونية في أنبوب يحتوي على 5 مل من LB. لوحة اليسار يظهر ثقافة عرض التعكر غرامة موحد نموذجي لE. نقي كولاي ثقافة. وفي المقابل، فإن لوحة اليمين يظهر ثقافة الملوثة فيها خصائص نمو تحيد عن تلك المتوقعة لهذه السلالة البكتيرية.

"لا يجوز> الأخطاء التقنية تحدث عند التعامل مع ماصات المصلية مما أدى إلى نقل كميات غير صحيحة من وسائل الاعلام بين أنابيب الاختبار. وعلى سبيل المثال، كنت قد قرأت وحدة التخزين على ماصة غير صحيح (أي أعلى مقابل أسفل الغضروف المفصلي) أو قد طرد وسائل الإعلام تماما من ماصة TD، الذي تم تصميمه لترك جزء صغير في الطرف لم يتم تسليمها. عند تنفيذ تسليم من نقطة إلى نقطة وسائل الإعلام، يمكنك استخدام علامات معايرة خاطئة والاستغناء عن وحدة التخزين غير صحيح. 8B ويبين الشكل مثال على أنابيب اختبار مع وحدات التخزين الصحيح مقابل غير صحيح من وسائل الإعلام. الأنبوب على اليسار تحتوي على 3.5 مل من LB يقاس مع ماصة 5 مل المصلية. وأجرى الطلاب تسليم من نقطة إلى نقطة وسائل الإعلام التي تم استخلاصها حتى LB إلى تخريج 5.0 مل والاستغناء عن علامة إلى علامة 1.5 مل. الأنبوب على اليمين يحتوي على 2.5 مل من LB يقاس مع ماصة من نفس الحجم لأن الطالب الذي أجرى عملية الولادة من نقطة إلى نقطة وسائل الاعلام من أناالاستغناء ncorrectly من علامة مل 5.0 إلى 2.5 مل علامة. وهذا خطأ يؤدي إلى ثقافة البكتيرية التي من شأنها أن تكون على تركيز أعلى مما كان مخططا له، مما تسبب في التخفيفات لاحقة لتكون غير صحيحة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انتشار الأخطاء في تجربة فاشلة أن هناك ضرورة لتكرارها مع تركيز الخلية الصحيحة.

ويظهر تطبيق نموذج لاستخدام micropipettors لنقل السوائل في الشكل 9. وتستخدم هذه pipettors لمجموعة متنوعة من التجارب في مجال البيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء المجهرية بما في ذلك إعداد عينات لPCR والكهربائي للهلام أو تحصين وسائل الاعلام عقيمة أو عازلة مع كميات صغيرة (أقل من 1.0 مل) من الخلايا البكتيرية أو جزيئات فج. في المثال المقدمة، ونقل الطلاب 12.5 ميكرولتر من العازلة الشركة المصرية للاتصالات في أنبوب microcentrifuge 1.8 مل (أنبوب اليسار في لوحة A؛ علما أنه تمت إضافة صبغ إلى المخزن المؤقت لتسهيل التصور من السائل داخل الأنابيب microcentrifuge واضح).مطلوب هذا الإجراء أول طالب لتحديد micropipettor الصحيح، في هذه الحالة P20، والمقبل لوضع volumeter إلى وحدة التخزين الصحيح (لوحة B). تم استخدام معلومات سرية تحتوي على المكونات القطن والصوف في نهاية لمنع التلوث المحتملة التي يمكن طردهم من برميل من micropipettor من الوصول إلى عينة العازلة في الطرف. هذا الحذر ليس من الضروري إذا أخذ الحذر عند الشفط السوائل الى نصائح، تضغط على المكبس ببطء حتى السائل لا دفقة في برميل pipettor. قد تحدث أخطاء فنية التي تؤدي إلى نقل وحدات التخزين غير صحيح. على سبيل المثال، قد قمت بتحديد micropipettor خاطئ للحصول على الوظيفة أو تعيين volumeter على micropipettor الصحيح إلى وحدة تخزين غير صحيح. قبل غمر طرف في المخزن المؤقت، قد دفع المكبس الماضي المحطة الأولى، مما تسبب في وجود فائض من العازلة التي يمكن استخلاصها في تلميح عند الافراج عن الغواص. بدلا من ذلك، قد لا تزج غيض بعيدا بما فيه الكفاية في المخزن المؤقت، بحيث يتم سحب الهواءفي تلميح بدلا من المخزن. قد ننسى لدفع المكبس إلى المحطة الثانية عندما الاستغناء عازلة داخل الأنبوب microcentrifuge تسبب أقل من حجم المطلوب أن يصدر من الطرف. الأنبوب الحق في اللوح من ويبين الشكل 9 أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على وحدة التخزين غير صحيح من عازلة بالنسبة للأنبوب على اليسار. بدلا من الاستغناء عن 12.5 ميكرولتر من العازلة، والاستغناء عن 125 طالب ميكرولتر. في هذه الحالة، على الرغم من أن يتم تعيين أرقام مماثل على volumeter، تم اختيار micropipettor خاطئ لهذا المنصب (للطالب استخدام P200 بدلا من P20، لوحة B) مما أدى إلى وصول كمية أكبر بكثير من المخزن. إذا كان يستخدم هذا الحل لإعداد مزيج من الكواشف لتطبيق مثل PCR، فإن هذا خطأ تغيير التركيز النهائي لجميع المواد الكاشفة وأضاف في وقت لاحق إلى الأنبوب نفسه. وبالتالي، فإنه من غير المحتمل أن التجربة ستكون ناجحة، لأن إجراءات البيولوجيا الجزيئية مثلكما PCR تتطلب من جميع مكونات أن تكون بتركيزات معينة لرد فعل للعمل بشكل صحيح.

لأنها ليست دائما ممكنة لضمان micropipettors (وخصوصا من داخل برميل) هي عقيمة، لا يمكن إيجاد حلول الأوراق المالية تصبح ملوثة تسبب جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها حتى فشل عند إجراء التجارب. إذا باستخدام micropipettors لنقل الحلول العقيمة، فمن المستحسن أن يتم aliquots الحلول الأوراق المالية (وسائل الإعلام، العازلة، والمياه) باستخدام تقنية العقيم مع ماصات المصلية. ومن الشائع للحفاظ على العمل حلول الأوراق المالية في 15 مل أو 50 مل من أنابيب مخروطية العقيمة. هذه غالبا ما تكون أسهل للتلاعب في حين تشغيل micropipettor ويمكن استبدالها مع قسامة جديدة من الحل الأوراق المالية إذا كانت ملوثة أثناء نقل وحدة التخزين.

الشكل 1. مجال العقيمة التي أنشأها التيار الصاعد من لهب الموقد بنسن. إلى دقائقimize تلوث من الحلول العقيمة والثقافات، فمن الأهمية بمكان أن تتم كل التلاعبات في مجال عقيم. وينبغي تمرير الحافات من أنابيب الزجاج وقوارير ثقافة من خلال غيض من مخروط الزرقاء، وجزء من سخونة اللهب. لا يمكن أن أنابيب بلاستيكية ونصائح يمكن ملتهب - يجب أن تكون هذه مسبقا من قبل وسائل بديلة للتعقيم قبل استخدامها.

الشكل 2. الماصات السيرولوجية المستخدمة لنقل السوائل المعقمة. (أ) يظهر من اليسار إلى اليمين رسومات من 25 مل، 10 مل و 5 مل الماصات. (ب) قد يكون المصلي الماصات البلاستيكية أو الزجاجية. الماصات البلاستيكية والتخلص منها (استخدام لمرة واحدة)، وعادة ما يتم تغليفها منفردة في الأكمام الورق والبلاستيك في كل الأسطح التي هي عقيمة داخل (الجانب الأيسر). ويمكن استخدام ماصات زجاج عدة مرات شريطة أن يتم تنظيفها وتعقيمها بين يستخدم، وهذه عادة ما يتم تخزينها في علب معدنية (يمينالجانب).

الشكل 3 ماصات المصلية هي من نوعين: TC ("لاحتواء") أو TD ("لتقديم"). أظهرت هو التسمية التوضيحية من ماصة TD 5 مل.

الشكل 4. تقنية العقيم. عندما الشفط السوائل من قنينة، قارورة، أو أنبوب مع قبعات، لم يضع قبعة على مقاعد البدلاء. بدلا من ذلك، عقد الغطاء في يد نفس ماصة المساعدات في حين التلاعب في وعاء يحتوي على السائل مع الجانب المعاكس كما هو موضح.

الشكل 5. شكل السطح المحدب عندما سحب السائل إلى ماصة المصلية. حجم يتوافق مع علامة التخرج على ماصة حيث الجزء السفلي من الغضروف المفصلي محاذاة. وفي هذا المثال، والغضروف المفصلي محاذاة مع gradua 2.5 مل نشوئها علامة.

الشكل 6. واحدة micropipettor قناة. (A) المبين هو micropipettor عينة مع طرف البلاستيكية التي تعلق على الجزء السفلي من حامل طرف برميل. وأشارت هي المواقع من volumeter، عجلة الإبهام لتغيير وضع volumeter، صاحب رأس برميل، الزر قاذف طرف، والضغط على زر وللالغطاس. (ب) التوقف مرتين الغطاس النظام على micropipettor.

الشكل 7. استخدام ماصات المصلية لنقل وسائل الاعلام الى قوارير 125 مل العقيمة. القارورة اليسار على 25 مل من وسائل الاعلام فقط (LB)، في حين أن الصحيح هو قارورة ثقافة E. القولونية الناجمة عن بتلقيح LB مع الخلايا احتضان ثم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. لاحظ كيف يتم عكر وسائل الإعلام في قارورة على الحق نظرا لنمو الخلايا.

ه 8 "SRC =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
الرقم 8. باستخدام ماصات المصلية لنقل وسائل الاعلام في أنابيب اختبار عقيم. (A) واليسار أنبوب يحتوي على 5 مل من E. نقي ثقافة القولونية، في حين أن حق أنبوب يحتوي على 5 مل من ثقافة الخلية البكتيرية الملوثة. لاحظ الاختلافات في خصائص النمو بين الثقافتين. على الرغم من أن عكر على حد سواء، قد تلوثت الثقافة على اليمين مع نوع من الفطريات أو الكائنات الدقيقة المحمولة جوا أخرى تعطي ثقافة بلون مختلف والاتساق من المتوقع أن لE. كولاي الخلايا. (ب) وأنبوب ثقافة اليسار تحتوي على 3.5 رطل مل في حين أن أنبوب حق يحتوي سوى 2.5 مل LB. أدى هذا الاختلاف حجم من خطأ ارتكب أثناء إجراء تسليم من نقطة إلى نقطة من وسائل الإعلام للأنابيب.

الشكل 9. النقيبmicropipettors ز لنقل العازلة في أنابيب microcentrifuge العقيمة. (A) وأنبوب microcentrifuge اليسار يحتوي فقط على 12.5 ميكرولتر من العازلة الشركة المصرية للاتصالات، في حين أن أنبوب يحتوي على حق 125 ميكروليتر. لاحظ أنه تمت إضافة صبغة إلى المخزن المؤقت لتسهيل التصور من السائل داخل الأنابيب microcentrifuge واضح. (ب) وvolumeter اليسار هو من micropipettor P20، في حين أن volumeter الحق هو من micropipettor P200. وهناك خطأ شائع هو اختيار micropipettor خاطئ. وعلى الرغم من تعيين عدد مماثل في volumeter P20 وP200، واختيار من نتائج micropipettor الخطأ في نقل وحدات التخزين غير صحيح.

الشكل 10. رقائقي تدفق غطاء محرك السيارة المستخدمة لمنع التلوث من الحلول والثقافات. أظهرت هو مجلس الوزراء وافق السلامة الحيوية للعمل مع BSL-2 الكائنات الحية.

Discussion

تقنية العقيم ويشير إلى مجموعة من الإجراءات الروتينية القيام به لمنع الحلول العقيمة والثقافات من أن تصبح ملوثة غير مرغوب فيه من قبل الكائنات الحية الدقيقة في المختبر. هذه التقنيات ضرورية لإجراء التجارب التي تتطلب الخلايا المتنامية. على الرغم من عدم إعداد العمل الذي هو عقيم تماما أن يتحقق، والإجراءات مثل تعقيم السطوح مختبر، وخلق مجال معقم باستخدام موقد بنسن، والحد من التعرض للثقافات لم يسبق لهم اللعب ووسائل الإعلام في الهواء، وتعقيم المواد مثل الأنابيب والزجاجات والماصات الزجاجية، وتجنب الاتصال مع الأدوات المعقمة غير معقمة أسطح يقلل من احتمال تلوث الحلول والثقافات في تجربة. والهدف من ذلك هو لهذه الإجراءات الاحترازية لتصبح طبيعة ثانية، وهذا يأتي مع التدريب والممارسة بينما كان يعمل في المختبر.

نقل وحدة التخزين مع حلول عقيمة والثقافات باستخدام أدوات مثل الماصات المصلية وهيئة التصنيع العسكريropipettors هي واحدة من العديد من أنواع تقنيات روتين عمله في أحد المختبرات. التطبيقات التجريبية المختلفة استدعاء لأدوات قادر على نقل متميزة، وأحجام دقيقة بعد دقيقة و،. وتستخدم ماصات المصلية في مختبرات علم الأحياء الدقيقة لإعداد مزارع الخلايا التي تتطلب استعدادات وسائل الإعلام التي تشمل وحدات التخزين ملليلتر، بينما micropipettors ضرورية لتجارب البيولوجيا الجزيئية التي تحتاج إلى كميات ميكروليتر فقط من الحلول. عندما يمارس أسلوب العقيم مع هذه الصكوك، والتقليل من التلوث أثناء عمليات النقل بغض النظر عن حجم كمية من السائل أو النوع من التجارب.

على الرغم من عدم مناقشتها في هذا البروتوكول، واحد وسيلة أخرى تستخدم عادة لمنع التلوث هو العمل داخل غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي (الشكل 10). هذه المعدات هو أمر حاسم لزراعة الأنسجة وللتجارب أجريت مع الكائنات الحية الدقيقة المصنفة BLS-2 أو أعلى. غطاء تدفق رقائقي يحتوي على (HEPA ذات الكفاءة العاليةالهواء جسيمات) مرشح أن يزيل الملوثات المحمولة جوا من الجو التي تصب في غطاء محرك السيارة في حين منع الهواء فلتر من غرفة من تتخلل مساحة العمل. من المذكرة، لا يمكن أن تستخدم موقد بنسن داخل الصفحي غطاء محرك السيارة، لأن تدفق الحرارة من لهب يعطل تدفق الهواء أساسي إلى وظيفة غطاء محرك السيارة.

غالبا ما يكون من المفيد للتحقق من جودة الأسلوب الخاص بك العقيم عند تنفيذ التجارب العملية. للتأكد من الحلول وليس وسائل الإعلام ثقافة للتلوث خلال التلاعب التجريبية، وإعداد عنصر تحكم دائما سلبية. على سبيل المثال، إذا كان إعداد أنابيب من مرق لنمو الثقافات البكتيرية، لا تطعيم أنبوب واحد ترك وسائل الاعلام فقط العقيمة. احتضان والمتوسطة إلى جانب أنابيب تلقيح ثم تفقد السيطرة أنبوب uninoculated بحثا عن علامات على تلوث مثل تعكر من نمو الخلايا غير المرغوب فيها وعرض عن غير قصد في أنبوب. إذا كانت ملوثة أنبوب السيطرة، وأنبوب التجريبيةمن المرجح تكون ملوثة أيضا، وهذه التجربة لا بد من تكرارها. وينبغي القيام بهذه التدابير الاحترازية مع كل تجربة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Difco Laboratories	244620	Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	Disinfectant
Ethanol	Fisher Scientific	A406	For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water