Aseptische Laboratoriumtechniek: Volume Transfers met serologische Pipetten en Micropipettors

Summary

Bij het werken in een laboratorium is het noodzakelijk te minimaliseren bronnen van verontreiniging. Aseptische techniek heeft betrekking op procedures die de overdracht van culturen en reagentia toe terwijl het vermijden van contact met niet-steriele oppervlakken. Serologische pipetten en micropipettors worden gebruikt om de precieze hoeveelheden te meten zonder afbreuk te doen aan de steriliteit van de oplossingen die gebruikt worden in experimenten.

Abstract

Micro-organismen zijn overal - in de lucht, de bodem, en het menselijk lichaam en op levenloze oppervlakken, zoals het laboratorium banken en toetsenborden van computers. De alomtegenwoordigheid van microben zorgt voor een uitgebreid aanbod van potentiële contaminanten in een laboratorium. Van experimentele succes te garanderen, moet het aantal verontreinigingen op apparatuur en werkbladen worden geminimaliseerd. Vaak voor bij vele experimenten in de microbiologie zijn technieken waarbij de meting en de overdracht van culturen met bacteriële cellen of virale deeltjes. Om dit te doen zonder contact met niet-steriele oppervlakken of besmettende steriele media vereist (1) de voorbereiding van een steriele werkruimte, (2) precies en nauwkeurig instellen van het lezen van instrumenten voor aseptische overdracht van vloeistoffen, en (3) goed manipuleren van instrumenten, culturen flacons, flessen en buizen in een steriel veld. Het leren van deze procedures vraagt ​​om opleiding en praktijk. In eerste instantie moeten acties traag, weloverwogen, en gecontroleerd met als doel voor aseptische technique een tweede natuur geworden bij het werken op de bank. Hier presenteren we de stappen voor het meten van volumes met behulp van serologische pipetten en micropipettors binnen een steriel veld gecreëerd door een bunsenbrander. Volumes van microliter (il) tot milliliter (ml) afhankelijk van de gebruikte instrument. Vloeistoffen vaak overgedragen omvatten steriele bouillon of chemische oplossingen, alsmede bacteriële culturen en faag voorraden. Door het volgen van deze procedures, moeten studenten in staat zijn om:

• Het werk binnen het steriele veld gecreëerd door de bunsenbrander vlam.
• Gebruik serologische pipetten zonder afbreuk te doen instrument steriliteit.
• Zuig vloeistoffen met serologische pipetten, juist het lezen van geijkte volumes door het gelijktrekken van de meniscus gevormd door de vloeistof aan het afstuderen markeringen op de pipet.
• Houd cultuur flessen, flacons, tubes en hun respectieve caps steriele vloeistof tijdens transfers.
• Identificeer verschillende toepassingen voor kunststof ten opzichte van glas serologische pipEttes.
• Staat nauwkeurigheid beperkingen voor micropipettors.
• Precies en nauwkeurig in te stellen volumes op micropipettors.
• Weet hoe goed de eerste en tweede stop op een micropipettor te gebruiken om te zuigen en over te dragen juiste volumes.

Protocol

1. Bereid een steriele werkruimte

1. Voordat u begint met een sterilisatie procedures in uw werkgebied, grondig uw handen met antiseptische zeep en warm water.
   • Zorg ervoor dat u opnieuw uw handen wassen wanneer u vermoedt dat u besmetting van je experimentele manipulaties.
2. Ruim alle materialen verrommeling uw werkgebied op de laboratoriumtafel. Verwijder een pre-bevochtigd ontsmettingsdoekje uit de bus en veeg het hele gebied. Laat het ontsmettingsmiddel laten verdampen - niet droog!
   • Gebruik ontsmettingsmiddelen zoals alcohol (isopropanol of 70% ethanol) of fenolische verbindingen (o-fenylfenol).
   • Om aërosolvorming of de productie van een fijne nevel met bacteriële cellen, en verspreiding van microbiële verontreinigingen voorkomen, moet het afgeven van een desinfectiemiddel knijpfles.
   • Verdroging van micro-organismen is een van de meest effectieve manieren om oppervlakken te ontsmetten.
   • Zelfs als iemand de laatste tijd het laboratorium bank gebruikt en het tafelblad werd afgeveegd met een desinfecterend middel, ALTIJD beginnen met uw laboratorium tijd door te vegen beneden de bank.
3. Na het desinfectiemiddel volledig droog is, gebruik maken van een ontsteker om de Bunsen brander aan te steken. De vlam zodat een blauwe kegel kan worden gezien in het midden van de vlam. De vlam wordt nu de productie van een opwaartse luchtstroom, of door de lucht convectiestromen in die warme lucht stijgt op en weg van de vlam (figuur 1). Als warmte stijgt, worden micro-organismen en stofdeeltjes naar boven en weg gedwongen uit de directe werkgebied. Werk langzaam, zorgvuldig en bewust te allen tijde in dit gebied die door de brander en aangeduid als een steriele. Houd de bunsenbrander tijdens de gehele procedure.
   • De tip van de blauwe kegel is het heetst van de vlam.
   • Pas op dat de opwaartse luchtstroom verstoren door snelle bewegingen die drastisch veranderen de air stromingen rond het laboratorium bank. Het creëren van een opwaartse luchtstroom met de bunsenbrander minimaliseert de kans op micro-organismen en stof vallen op de bank of in open flessen, tubes of flesjes in het werkgebied.
4. Leg alle benodigdheden die nodig zijn voor de procedure op het laboratorium bankje in de buurt van het steriele veld. Zorg ervoor dat alle materialen correct geëtiketteerd zijn.
   • Leveringen kunnen serologische pipetten en micropipettors, steriele cultuur buizen, steriele kolven, media flessen met bouillon, steriele PCR-micropipettor tips, rekken voor buizen, bacteriële cel culturen, en faag voorraden.
   • Vloeibare media worden gesteriliseerd in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 15 minuten op de vloeistof instelling. Grotere volumes van de media (> 1L) vereisen een langere autoclaaf tijden. Labware worden gesteriliseerd in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 minuten op gewicht (droge) instelling.
   • In het algemeen kan steriele oplossingen worden bewaard bij 4° C tot 5 maanden. Merk op dat opslagtijd aanzienlijk wordt verminderd voor de oplossingen die onstabiele componenten zoals antibiotica - Controleer altijd de aanbevelingen van de fabrikant.

2. Het doorvoeren van vloeistoffen Met behulp van serologische pipetten

1. Serologische pipetten zijn er in vele maten en mogelijkheden: kunststof of glas, eenmalige of meermalige, aangesloten of verwijderd. Deze worden gekalibreerd om volumes variërend van een 0,1 ml tot 25 ml.
   • Gemeenschappelijke maten serologische pipetten zijn 5 ml, 10 ml en 25 ml en worden gebruikt voor aseptische vloeibare overdracht van 0,1 ml of meer (paneel A van figuur 2). Er zijn ook grotere serologische pipetten die volumes kan leveren tot 100 ml, maar de focus van dit protocol is op de meest voorkomende, kleinere pipetten.
   • Vooraf gesteriliseerd pipetten met een katoenen watje nodig zijn voor de microbiologie en weefselkweek experimenten. De plug niet worden verwijderd uit de aanp van de pipet, is ontworpen om te functioneren als een barrière om overvulling van de pipet.
   • Verschillende toepassingen vragen om plastic versus glas serologische pipetten. Glas nodig voor organische oplosmiddelen. Beiden kunnen worden gebruikt bij het uitvoeren van BSL-1 experimenten op de laboratoriumtafel top. Alleen kunststof kan worden gebruikt bij werken in een kast met bioveiligheid BSL-2 organismen waarbij een Bunsen-brander niet worden gebruikt. Ook wordt aanbevolen kunststof worden gebruikt voor toepassingen waarbij de overdracht van gesmolten agar.
   • Serologische pipetten zijn twee soorten: TC ("te bevatten") of TD ("te leveren"). TC pipetten leveren alle het volume, met inbegrip van de punt, en moet worden "weggeblazen" of gespoeld om het opgegeven volume te krijgen. TD pipetten worden gekalibreerd op een heel klein beetje achter in de punt die niet mogen worden afgeleverd. Zorg ervoor dat het etiket te controleren op het lichaam van de pipet buurt van de top om na te gaan welk type het is (figuur 3). De meest gebruikte TD pipetten, die marnent met dubbele ringen boven.
2. Neem een ​​steriele plastic serologische pipet (ook wel een volumetrische transferpipet) en voorzichtig de papieren hoes te verwijderen aan het einde met de watten plug door het weg te pellen als de huid van een banaan - verwijder niet de hele mouw, de bescherming van de punt van de pipet die in contact komen met de vloeistof over te dragen. Raak alleen de top van de pipet (boven de maatstreepjes) met je handen.
   • Ga nooit in een steriele oplossing met een pipet gebruikt, zelfs als de grootste zorg is besteed aan het houden steriel.
   • Glas serologische pipetten worden meestal opgeslagen in blikken (panel B van figuur 2). Maak de bovenkant van de bus dan verwijder voorzichtig de dop, en de vlam van de open einden van de dop en bus. Plaats de dop naar beneden, op zijn kant, op de gedesinfecteerde bank. Neem een ​​pipet uit de bus door vast te houden horizontaal en zachtjes schudden, zodat de toppen van een of twee pipettes uit te steken ongeveer een centimeter en kan gemakkelijk worden begrepen. Leg de bus op zijn kant en verwijder een pipet, maar wees voorzichtig dat u de andere pipetten in de container aan te raken. Laat de onderste punt van de pipet niet aan met je handen, en voorkom contact van de tip met andere niet-steriele oppervlakken.
3. Aanbrengen van een pipet steun zoals een lamp, pomp of gun het boveneinde van de serologische pipet. Verwijder het papier bus uit de plastic pipet. Houd de pipet hulp in je rechterhand.
   • Bij gebruik van een glazen pipet, langs het onderste derde deel van de pipet door de blauwe kegel in de bunsenbrander vlam voor 1-3 seconden. Draai de pipet 180 ° als het door de vlam. Plastic pipetten en buizen kan niet worden gevlamd.
   • Als linkshandige, Houd de tube hulp in je linkerhand en gedragingen die plaatsvinden na manipulaties van cultuur flessen en tubes met uw rechterhand.
   • Besmetting treedt meestal op met plastic pipetten bij het intrekken van de laatste inches van de pipet van de huls door het steriel uiteinde in aanraking komt met het deel van de mof aangeraakt handen.
4. Verwijder de dop van de fles met steriele media. Plaats de dop op het laboratorium bank, maar het tussen uw ringvinger en de palm van de rechterhand, terwijl het manipuleren van de pipet steun met de duim te houden, wijsvinger en middelvinger van dezelfde hand (figuur 4). Houd de fles in een hoek van 45 °, langs de rand van de fles door de vlam van de bunsenbrander, het creëren van een steriel veld rond de open fles.
   • Hoewel het best vermeden, als je moet de dop neerzetten, plaats het gezicht naar beneden op een gedesinfecteerde oppervlak. Met een kap die naar boven is er een grotere kans op besmetting van bewegingen van voorwerpen of handen, waardoor luchtstromen die leiden micro-organismen en stofdeeltjes te dalen naar de binnenzijde van de kap.
   • Het doel van brandende niet te steriliseren maar de opening o verwarmenf de fles en maak convectie stromen tot en weg van de opening (dat wil zeggen, opwaartse luchtstroom). De warme, opstijgende lucht helpt voorkomen dat stofdeeltjes en andere verontreinigingen uit het invoeren van de fles.
   • Houd de steriele container open voor zo weinig mogelijk tijd. Het is belangrijk te houden de in-lucht van micro-organismen tot een minimum te onderhouden.
   • Vermijd hoesten, niezen, praten, en andere plotselinge verplaatsing, terwijl steriele containers open zijn.
   • Geef nooit uw handen en vingers over de bovenkant van een steriel veld (dat wil zeggen, open flessen of flacons, de binnenkant van buizen en doppen), zodra ze zijn doorgegeven via de bunsenbrander vlam.
   • Werk altijd met een open vlam bij het openen van steriele buizen of flessen. Nooit meer dan een tube, fles of kolf open de bank een. Flaming dient onmiddellijk te worden gedaan bij het openen en net voor sluitingstijd tubes, flessen en flacons.
5. Plaats het topje van de seroltief voor farmacologische pipet in de fles met de steriele media dan te zuigen, of aseptisch te trekken van het monster, uit de fles. Met de pipet steun aan de stroom van het monster in de pipet controleren. Juist lezen volume getrokken in de pipet door aanpassing van de meniscus gevormd boven de vloeistofkolom de maatverdeling op de gekalibreerde pipet (figuur 5).
   • NIET MOND PIPET! Gebruik altijd een pipet hulp (pomp, lamp, of pistool).
   • Let op de cijferreeks bij het bepalen van het volume aangezogen. De nummers worden gedrukt tip naar boven of vice versa, of vaak tijden in beide richtingen.
   • Bij het lezen van het volume, altijd aan de pipet verticaal, loodrecht op de grond, en bekijk de vloeistof meniscus dood-on op ooghoogte.
   • Serologische pipetten zijn zo nauwkeurig als de kleinste duidelijke toename, die typisch is 0,1 ml voor 5 ml en 10 ml pipetten en 0,2 ml voor 25 ml pipetten. Ikf grotere nauwkeurigheid nodig is, kan een serologische pipet in combinatie met een micropipettor.
6. Haal de rand van de fles door de bunsenbrander vlam opnieuw en plaats de dop terug op de fles. Leg de media fles.
   • Niet verbranden te maken met de bunsenbrander in een rush naar de fles af te sluiten.
7. Houd een reageerbuis of flesje in je linkerhand. Verwijder en houd de dop, zoals beschreven in stap 4 hierboven. Maak een steriel veld door vlammende de rand van de buis of kolf in de bunsenbrander.
8. Breng de media in de pipet in de buis of de kolf. De stroom van het monster zodat het niet uit spatten van de buis of kolf.
   • Volumes kan worden gemeten, zodat de gehele volume wordt geleverd en de pipet afvoer geheel of een bepaalde hoeveelheid wordt bereikt door op het point-to-point levering (een volume markering andere).
9. Haal de rand van de buis of fles door de Bunsen brandwondenER vlam weer, dan de dop. Leg de buis of kolf. Haal de pipet hulp, en gooi de pipet in de juiste afvalbak.
   • Plastic serologische pipetten worden verwijderd, terwijl het glas serologische pipetten kan worden gesteriliseerd en opnieuw gebruikt. Met een correcte verwerking vereist plastic pipetten worden geplaatst in een daarvoor bestemde naaldencontainer (starre doos bekleed met plastic afvalzak), terwijl de glazen pipetten in eerste instantie dient te worden ondergedompeld in een bak met 10% bleekwater oplossing voor het binnen en buiten oppervlakken te desinfecteren. Dan is de glazen pipetten moeten grondig worden gewassen met laboratorium reinigingsmiddel, gespoeld met gedestilleerd water, en gesteriliseerd in een autoclaaf.
10. Deze zelfde stappen moeten worden gevolgd bij het enten media met een bacteriecultuur of faag voorraad of bij het uitvoeren van seriële verdunningen.

3. Het doorvoeren van vloeistoffen Met behulp van Micropipettors

1. Juist het meten en doseren minuten volumes kunnen accomplistal met micropipettors (ook wel Pipetman, Paneel A van figuur 6). Deze instrumenten zijn er in verschillende maten met elk een specifiek volume bereik: P2 voor 0.2-2 ul, P10 voor 1-10 ul, P20 voor 2-20 ul, P200 voor 20-200 ul, en P1000 voor 200-1000 ul.
   • Behandel micropipettors met zorg, zoals ze zijn precisie-instrumenten. Laat ze niet liggen op de laboratoriumtafel zonder toezicht waar ze kunnen worden gestoten en beschadigd. Sta niet toe dat pipetten in contact komt met corrosieve chemicaliën.
   • Voor hoeveelheden van meer dan 1000 il, gebruik dan een serologische pipet.
   • Hoewel het werken binnen het steriele veld gecreëerd door de bunsenbrander, geen vlam micropipettors, buizen en plastic tips. De buizen en tips moet vooraf zijn gesteriliseerd. De micropipettors kan worden afgeveegd met een vooraf bevochtigd ontsmettingsdoekje voor gebruik.
2. Een numerieke volumeter met het verspoten volume kan worden ingesteld door te draaien aan draaiknop. Adjust het volume zachter voordat u verder gaat met stap 3.
   • NOOIT Draai de regelknop BOVEN het juiste bereik!
   • Om een ​​maximale nauwkeurigheid te verkrijgen bij het verminderen van de volume-instelling op de micropipettor, langzaam naar beneden te kiezen de duim wiel, en zorg ervoor niet te overshoot de streep.
   • Om een ​​maximale nauwkeurigheid te verkrijgen bij het verhogen van de volume-instelling op de micropipettor, inbellen de duim wiel, het passeren van de gewenste streep door 1/3 van een bocht. Dan langzaam naar beneden te kiezen de duim wiel om het beoogde volume te bereiken, en zorg ervoor niet te overshoot de streep.

   De volumemeter toont drie cijfers. Afhankelijk van de micropipettor zijn de getallen anders geïnterpreteerd. Merk op dat elke micropipettor is maar zo nauwkeurig als de kleinste streep.

   P2: Voor volumes tussen de 0.2-2.0 ul. Het bovenste getal geeft volume microliter. Het tweede nummer Aanwijses tienden van een microliter (0,1 pi) en het derde aantal is honderdsten microliter (0,01 pl). Elke streep komt overeen met een toename van twee een-duizendste (0,002 ul) van een microliter.

   P10: Voor volumes tussen 1,0-10,0 ul. Het bovenste getal is voor tientallen microliter, dit meestal is ingesteld op "0" en dient alleen te worden ingesteld op "1" met de andere twee nummers in te stellen op "0" bij het opbrengen van 10,0 ul. Het cijfer geeft volume microliter. De derde aantal geeft tienden microliter (0,1 pi). Elke streep komt overeen met een toename van twee een-honderdste (0,02 ul) van een microliter.

   P20: Voor volumes tussen 2,0-20,0 ul. Het bovenste getal in het zwart is voor tientallen microliter, dit dient alleen te worden ingesteld op "2" met de andere twee nummers in te stellen op "0" bij het opbrengen van 20,0 ul. Het tweede nummer in het zwart staat voor het volume in microliter. Het derde nummer in rood geeft tienths een microliter (0,1 pi). Elke streep komt overeen met een toename van twee een-honderdste (0,02 ul) van een microliter.

   P200: Voor volumes tussen de 20,0 tot 200 pl. Het bovenste getal is voor honderden microliter, dit dient alleen te worden ingesteld op "2" met de andere twee nummers in te stellen op "0" bij het opbrengen van 200 pi. Het middelste cijfer geeft het verspoten volume in tientallen microliter, en het derde getal geeft volume in microliter. Elke streep komt overeen met een toename van twee een-tiende (0,2 pl) van een microliter.

   P1000: Voor volumes tussen 200-1000 ul. Het bovenste getal is voor duizenden microliter, dit meestal is ingesteld op "0" en dient alleen te worden ingesteld op "1" met de andere twee nummers in te stellen op "0" bij het opbrengen van 1000 ui. Het middelste cijfer is voor honderden microliter. De onderste nummer is voor tientallen microliter. Elke streep komt overeen met een toename van twee (2 pi) microliter.

   • Prestaties controleren: Deze instrumenten moeten jaarlijks worden gekalibreerd, waardoor de nauwkeurigheid en precisie worden onderhouden om te blijven binnen ± 5% van de specificaties. Gebruik een analytische schaal om water te meten, zorg ervoor dat de minimale en maximale instellingen overeenkomen met de beoogde volume. Gebruik bijvoorbeeld een P1000 de overdracht 200 ul water aan de wegen schotel op de schaal. Daar water een dichtheid van 1 dan 1 ml water gelijk is aan 1 gram (g). Daarom moet 200 pi (0,2 ml) water gelijk aan 0,2 g. Zorg er ook voor de tip niet gaan lekken en kan behouden tot het gewenste volume aangebracht met zuiger-systeem.
3. Micropipettors worden gebruikt met kunststof wegwerpnaalden allen tijde. Strak een tip op het uiteinde van de loop van de micropipettor. Druk en draai iets naar een luchtdichte afdichting te garanderen.
   • Tips worden meestal verpakt in plastic dozen die kunnen worden gesteriliseerd door autoclaveren. Open de tip in om een ​​tip te halenEn sluit de top box om contact te minimaliseren met verontreinigingen in de lucht.
   • Enkele tips hebben filters vergelijkbaar met de propjes watten op een serologisch pipetten. Deze tips zijn vaak duurder dan de reguliere tips en dus worden gebruikt voor gespecialiseerde toepassingen. Wanneer bijvoorbeeld het meten van vluchtige stoffen zoals chloroform of radioactieve middelen zoals ^32P-gelabeld DNA met filter uiteinden helpt de loop van de micropipettor van raken verontreinigd.
4. Houd de micropipettor in een verticale positie.
   • Houd de micropipettor rechtop wordt voorkomen dat vloeistoffen worden uitgevoerd binnen en vervuilen de loop van de micropipettor.
5. De micropipettor drie standen: (1) ruststand (2) eerste aanslag en (3) tweede stop (Figuur 6, B). Het instrument heeft een twee-stop-zuiger systeem. Het eerste einde heeft twee functies. De eerste is om in het gewenste volume van de vloeistof in de punt when loslaten van de zuiger van de eerste aanslag van de ruststand. De tweede functie is de meerderheid van de vloeistof bevrijd van de tip bij het indrukken van de zuiger uit de ruststand naar de eerste stop. Verdere indrukken van de zuiger om de tweede halte ziet af welke vloeistof blijft in de tip.
   Druk de drukknop op de zuiger uit de ruststand naar de eerste stop. Lucht gelijk aan het volume van de instelling wordt verplaatst.
6. Dompel de tip in de vloeistof terwijl u de knop naar de eerste stop.
   • Gebruik de micropipettor zelf niet aan te raken aan de zijkanten van flessen, tubes en flacons, anders de binnenkant van deze schepen zullen worden besmet. Alleen de tips zijn steriel.
7. Langzaam Laat de knop om de vloeistof te zuigen in de tip. Stopt wanneer de drukknop naar de ruststand. Wacht even, zodat vloeistof kan worden getrokken in de tip.
   • Het volume van de vloeistof in de punt is gelijk aan het volume of de instelling van de micropipettor.
   • Viskeuze vloeistoffen zoals die bevatten glycerol meer tijd nodig hebben om de top te gaan.
8. Verwijder de tip van de vloeistof, en kijk na of de tip om te bevestigen dat de vloeistof opgesteld is het verwachte niveau in de top bereikt en zijn er geen luchtbellen in de tip.
   • Indien nodig, uitzetting van de vloeistof en handmatig draai de tips op de micropipettor. Opstellen van de vloeistof en controleer opnieuw.
9. Plaats het uiteinde onder een hoek (10 ° tot 45 °) tegen de wand van de buis die de vloeistof. Om de vloeistof te verdrijven, langzaam drukt u de knop op de zuiger tot de eerste stop. Wacht even dan is de knop te drukken om de tweede stop om het resterende vloeistof in de punt te verdrijven.
   • Op de zuiger te snel kan de vloeistof verdreven om spatten of zal ongewenste luchtbellen in de buis.
10. Voor het loslaten van de zuiger in de ruststand, opnieuwVerplaats de tip van de vloeistof.
11. Gooi tips in aangewezen slijpsel afvalcontainer door op de uitwerpknop op de micropipettor.

4. Het schoonmaken van de werkruimte

1. Wanneer u klaar bent met een experiment die met behulp van aseptische techniek, schakelt u de bunsenbrander, dan weggezet alle benodigdheden en reagentia. Veeg de buitenkant van laboratoriumartikelen (flessen, micropipettors, pipetpunt dozen) met een vooraf bevochtigd ontsmettingsdoekje om ervoor te zorgen verontreinigingen worden niet overgebracht naar de opslaglocatie.
2. Plaats verontreinigd glaswerk en gevaarlijke afvalstoffen in de juiste afvoer aansluiting. Laboratorium afval omvat laboratoriumartikelen, zoals handschoenen, pipetten, tips, en buizen. Niet-infectieuze gevaarlijk afval wordt gegenereerd bij het uitvoeren van experimenten met niet-pathogene organismen (BSL-1), terwijl besmettelijk gevaarlijk afval wordt gegenereerd bij het gebruik van pathogene organismen (BSL-2 of hoger). Besmettelijk afval moet geautoclaveerd of gedesinfecteerd befor zijne het is weggegooid. Volg de EU-veiligheidsrichtlijnen beschreven in BMBL (5 ^e Ed.) Als die welke door OSHA en institutionele Environmental Health and Safety afdelingen.
3. Veeg het hele werkgebied op het laboratorium bank met een vooraf bevochtigd ontsmettingsdoekje uit de bus, weer waardoor het desinfecterende middel te laten verdampen.
4. Was je handen grondig met antiseptische zeep en warm water voor het verlaten van het laboratorium.

5. Representatieve resultaten

Een monster aanvraag gebruikt serologische pipetten vloeistoffen overdracht is weergegeven in figuur 7. Deze pipetten worden vaak gebruikt in de microbiologie laboratorium media bereiden van inoculatie met bacterieculturen. Bijvoorbeeld steriele kolven eerst worden gevuld met een bepaald volume van kweekvloeistof, in dit geval Luria Broth (LB) vervolgens een aantal cellen (zoals E. coli) worden toegevoegd aan het medium. Een serologische pipette, eerst de bouillon moet aseptisch worden overgedragen van de media fles aan de kolf. In dit geval werd 25 ml van LB toegevoegd aan een 125 ml kolf met een steriele 25 ml serologische pipet. Vervolgens moet de bouillon worden geënt met E. coli-cellen. Hier werden 10 ul van cellen aseptisch overgebracht met behulp van een P20 micropipettor van een eerder groeiende cultuur kolf van 25 ml vers LB. De kolf wordt geïncubeerd in een groeikamer voor een bepaalde tijd, waardoor de cellen repliceren (in dit voorbeeld de E. coli werden de cellen overnacht geïncubeerd bij 37 ° C op een schudplateau). Het resultaat is een troebele bacteriële celkweek die kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten.

Serologische pipetten tevens worden gebruikt om uit het wordt geleverd in een fles reageerbuizen dragen of over reageerbuizen, wordt volbracht bij het maken van verdunningen een bacteriecultuur. Als aseptische techniek wordt niet gedurende de gehele dit soort media-manipulaties , Dan culturen zullen worden besmet, en de daarop volgende experimenten met behulp van deze culturen zullen worden uitgesteld omdat verse, niet-verontreinigd culturen zullen moeten worden voorbereid. Fouten ontstaan ​​doordat een steriel veld niet wordt gehandhaafd tijdens de gehele procedure. Zo kan u vergeet om de laboratoriumtafel of vlam de rand van een cultuur fles of tube te desinfecteren. U kunt contact met de punt van de pipet of stelt u de dop van een fles of reageerbuis op de bank in plaats van vast te houden in je hand. Goede procedure is essentieel voor het houden verontreiniging van media en culturen tot een minimum. Figuur 8A is een voorbeeld van een zuivere kweek van verontreinigde versus E. coli in een buis met 5 ml LB. Het linker paneel toont een cultuur weergeven van uniforme fijne troebelheid typisch voor een zuivere E. coli cultuur. In tegenstelling, de rechter paneel toont een verontreinigde cultuur waarin de groeikarakteristieken afwijken van die verwacht voor deze bacteriële stam.

"> Technische fouten kunnen optreden wanneer het manipuleren van serologische pipetten wat resulteert in de overdracht van onjuiste hoeveelheden media tussen reageerbuizen. Bijvoorbeeld, je kan het volume te lezen op de pipet verkeerd (dat wil zeggen, boven versus onderkant van de meniscus) of u kunt verwijderen de media volledig van een TD-pipet, die werd ontworpen om een klein beetje achter in de tip niet te leveren. Bij het ​​uitvoeren van een point-to-point levering van media, kunt u gebruik maken van de verkeerde kalibratie merken en afzien van de onjuiste volume. Figuur 8B toont Een voorbeeld van buizen met goede versus onjuiste hoeveelheden media. De buis links bevat 3,5 ml van LB gemeten met 5 ml serologische pipet. De student uitgevoerd point-to-point levering van de media waarin LB opgesteld aan de 5,0 ml streep en afgegeven aan de 1,5 ml markering. De buis aan de rechterkant bevat 2,5 ml van LB gemeten met een pipet van dezelfde grootte, omdat de student die de uitgevoerde point-to-point levering van media-iverkeerd wordt geplaatst afgegeven uit de 5,0 ml markering aan de 2,5 ml markering. Deze fout resulteert in een bacteriecultuur die zich op een hogere concentratie dan voorzien, waardoor na verdunningen te kloppen. Deze voortplanting van fouten resulteren in een niet experiment dat zou moeten worden herhaald met de juiste cel concentraties.

Een monster aanvraag gebruikt micropipettors vloeistoffen overdracht wordt getoond in Figuur 9. Deze pipetten worden gebruikt voor diverse experimenten moleculaire biologie en microbiologie met bereiden monsters voor PCR en gelelektroforese of het enten steriele media of buffer met kleine hoeveelheden (minder dan 1,0 ml) van bacteriële cellen of faagdeeltjes. In die het voorbeeld de leerling overgedragen 12,5 pi TE-buffer in een 1,8 ml microcentrifugebuisje (linker panel A buis, op dat kleurstof toegevoegd aan de buffer visualisatie van de vloeistof in de heldere reactievaatjes vergemakkelijken).Deze procedure vereist het student eerst de juiste micropipettor selecteren, in dit geval een P20 en naast de volumemeter op de juiste volume (B). Een tip werd gebruikt met daarin een watje stekker aan het uiteinde om mogelijke verontreiniging die kunnen uit de loop van de micropipettor worden verdreven uit het bereiken van de buffer monster in de punt te voorkomen. Deze voorzorgsmaatregel is niet nodig als zorg wordt genomen bij het opzuigen van vloeistoffen in de tips, het indrukken van de zuiger langzaam, zodat de vloeistof niet spatten in de pipet vat. Technische fouten optreden die resulteren in de overdracht van onjuiste volumes. Zo kan u het verkeerde micropipettor voor de baan of stel de volumemeter op de juiste micropipettor op een verkeerde volume. Voor het onderdompelen van de tip in de buffer, kunt u de zuiger verder te gaan dan de eerste stop, waardoor een overmaat aan buffer op te stellen in de punt bij het loslaten van de zuiger. Als alternatief kunt u niet onder de punt ver genoeg in de buffer, zodat lucht wordt aangezogenin de punt in plaats van buffer. U mag vergeten om de zuiger te duwen tot de tweede stop bij het afgeven van buffer in de microcentrifugebuis waardoor minder dan het gewenste volume te worden vrijgesteld van de tip. De juiste buis in paneel A van figuur 9 toont een microcentrifugebuis met de onjuiste volume buffer opzichte van de buis aan de linkerkant. In plaats van afgeven 12,5 ßl buffer, de leerling afgegeven 125 pi. In dit geval, terwijl de nummers identiek ingesteld op de volumemeter is de verkeerde micropipettor gekozen voor de baan (de leerling gebruikt een P200 plaats van een P20, paneel B) leidt tot het leveren van een aanzienlijk grotere hoeveelheid buffer. Wanneer deze oplossing werd gebruikt om een ​​mengsel van reagentia bereiden van een toepassing zoals PCR, dan verandert de fout eindconcentratie van alle reagentia daarna in dezelfde buis. Bijgevolg is het onwaarschijnlijk dat het experiment succesvol te zijn, aangezien moleculaire biologie zoals proceduresals PCR vereisen dat alle componenten te zijn aan de concentraties voor de reactie goed te laten werken.

Omdat het niet altijd mogelijk om micropipettors (met name de binnenzijde van het vat) steriel zijn, kunnen stockoplossingen besmet waardoor zelfs oplossen pogingen falen bij het uitvoeren experimenten. Bij gebruik van micropipettors om steriele oplossingen over te dragen, is het sterk aanbevolen om fracties van de stamoplossingen (media, buffer, water) worden gemaakt met behulp van aseptische techniek met serologische pipetten. Het is gebruikelijk om de arbeidsgeschiktheid voorraad oplossingen in 15 ml of 50 ml steriele conische buizen. Deze zijn vaak gemakkelijker te manipuleren tijdens het besturen van een micropipettor en kan worden vervangen door een verse hoeveelheid van de voorraad oplossing als die tijdens het volume transfers.

Figuur 1. Steriel veld gecreëerd door opwaartse luchtstroom van de bunsenbrander vlam. Om minimize contaminatie van steriele oplossingen en culturen, is het essentieel dat alle handelingen vinden plaats in het steriele veld. De velgen van glas cultuur buizen en flacons dienen te worden doorgegeven via de punt van de blauwe kegel, het heetste deel van de vlam. Plastic buizen en uiteinden niet gevlamd - deze moet vooraf worden gesteriliseerd door alternatieve methoden voorafgaande aan gebruik.

Figuur 2. Serologische pipetten gebruikt voor aseptische overdracht van vloeistoffen. (A) Van links naar rechts zijn tekeningen van 25 ml, 10 ml en 5 ml pipetten. (B) Serologische pipetten kan plastic of glas. Plastic pipetten zijn disposable (eenmalig gebruik) en meestal zijn individueel verpakt in papier en plastic hoezen waarin alle binnenwanden zijn steriel (linkerkant). Glazen pipetten kan meerdere keren worden gebruikt, mits zij worden gereinigd en gesteriliseerd tussen gebruikt, deze meestal worden opgeslagen in metalen vaten (rechtskant).

. Figuur 3 Serologische pipetten Er zijn twee soorten: TC ("te bevatten") of TD ("te leveren"). Afgebeeld is de verklarende etiket van een TD 5 ml pipet.

Figuur 4. Aseptische techniek. Bij het opzuigen van vloeistoffen uit een fles, fles, of buis met kappen, mag u nooit de dop op de bank. In plaats daarvan houdt de dop in dezelfde hand als pipet hulpmiddel bij het manipuleren van het vat waarin de vloeistof met de andere hand, zoals weergegeven.

Figuur 5. Meniscus gevormd bij het ​​opstellen vloeistof in serologische pipet. De grootte overeenkomt met de streep op de pipet waarbij de bodem van de meniscus uitgelijnd. In dit voorbeeld de meniscus uitgelijnd met 2,5 ml afstuderen TIE merk.

Figuur 6. Eenkanaals micropipettor. (A) weergegeven is een voorbeeld micropipettor met een plastic punt aan de onderzijde van het vat tip houder. Aangegeven zijn de locaties van de volumemeter, het duimwiel voor het veranderen van de volumenmeter instelling, het vat tip houder, de tipejector knop en de knop voor de plunjer. (B) Twee-stop zuiger systeem op een micropipettor.

Figuur 7. Met behulp van serologische pipetten in de media over te dragen in steriele 125 ml flessen. De linker fles is 25 ml van de media alleen (LB), terwijl de rechter fles is een cultuur van E. coli als gevolg van enten met LB cellen vervolgens incubatie overnacht bij 37 ° C. Merk op hoe de media in de kolf aan de rechterkant wordt troebel als gevolg van de celgroei.

e 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Figuur 8. Met behulp van serologische pipetten in de media over te dragen in steriele reageerbuisjes. (A) De linker buis bevat 5 ml van een zuivere E. coli cultuur, terwijl de rechter buis bevat 5 ml van een verontreinigde bacteriële cel cultuur. Op het verschil in groei eigenschappen tussen de twee culturen. Hoewel beide zijn troebel, is de cultuur aan de rechter is besmet met een schimmel of andere micro-organismen in de lucht waardoor de cultuur van een andere kleur en consistentie van wat verwacht werd voor E. coli-cellen. (B) De linker cultuur buis bevat 3,5 ml LB terwijl de rechter buis bevat slechts 2,5 ml LB. Dit volume verschil het gevolg van een fout heeft gemaakt, terwijl het voeren van een point-to-point levering van media aan de buizen.

Figuur 9. Using micropipettors om buffer te zetten in steriele PCR. (A) De linker microcentrifugebuisje bevat slechts 12,5 pi TE-buffer, terwijl de rechter buis bevat 125 pi. Merk op dat een kleurstof is toegevoegd aan de buffer visualisatie van de vloeistof in de heldere reactievaatjes vergemakkelijken. (B) De linker volumemeter is van een P20 micropipettor, terwijl de rechter volumemeter is van een P200 micropipettor. Een veel gemaakte fout is het selecteren van de verkeerde micropipettor. Hoewel de nummers zijn identiek ingesteld op de P20 en P200 volumemeter, keuze van de verkeerde micropipettor resulteert in de overdracht van onjuiste volumes.

Figuur 10. Laminaire stroming kap gebruikt om verontreiniging van oplossingen en culturen voorkomen. Afgebeeld is een bioveiligheid kabinet goedgekeurd voor het werken met BSL-2 organismen.

Discussion

Aseptische verwijst naar een reeks van routine procedures gedaan steriele oplossingen en culturen voorkomen dat besmette van ongewenste micro-organismen in het laboratorium. Dergelijke technieken zijn essentieel voor experimenten groeiende cellen vereist. Hoewel een werkomgeving die volledig steriel kan niet worden bereikt, procedures, zoals desinfecteren laboratorium oppervlakken, het creëren van een steriel veld met een bunsenbrander, beperking van de blootstelling van de niet-afgetopte culturen en media aan de lucht, het steriliseren van materialen, zoals flessen, tubes en glazen pipetten, en het vermijden van contact van steriele instrumenten met niet-steriele oppervlakken vermindert de kans op vervuiling van oplossingen en culturen in een experiment. Het doel is dat deze voorzorgsmaatregelen procedures om een ​​tweede natuur geworden, dit komt met training en de praktijk tijdens het werken in een laboratorium.

Deel transfers met steriele oplossingen en culturen met behulp van instrumenten zoals serologische pipetten en microfoonropipettors een van vele soorten gebruikelijke technieken uitgevoerd in een laboratorium. Verschillende experimentele toepassingen roepen voor instrumenten die geschikt zijn om verschillende, maar precies en nauwkeurig, volumes. Serologische pipetten worden gebruikt in microbiologische laboratoria op celculturen die media voorbereidingen met betrekking tot milliliter volumes voor te bereiden, terwijl micropipettors zijn essentieel voor de moleculaire biologie experimenten die alleen microliter hoeveelheden van oplossingen nodig hebben. Wanneer aseptische techniek wordt beoefend met deze instrumenten, is besmetting tot een minimum beperkt tijdens het volume transfers, ongeacht hoeveelheid vloeistof of het type experiment.

Hoewel niet in dit protocol een andere middelen gebruikt om vervuiling te voorkomen is om te werken in een laminaire stroming kap (figuur 10). Dit apparaat is essentieel voor weefselkweek en experimenten met micro-organismen als BLS-2 of hoger. Een laminaire stroming kap bevat een HEPA (hoog rendementParticulate Air) filter dat verontreinigingen in de lucht verwijdert uit de lucht stroomt in de motorkap, terwijl het voorkomen ongefilterde lucht uit de kamer van doordringt de werkruimte. Van de nota kan een bunsenbrander niet worden gebruikt in een laminaire stroming kap omdat de warmte van de vlam verstoord luchtstroom van essentieel belang om de functionaliteit van de kap.

Het is vaak handig om de kwaliteit van uw aseptische techniek te controleren bij het uitvoeren van experimenten. Om oplossingen te bevestigen en cultuur media niet die tijdens het experimentele manipulaties krijgen, altijd voor te bereiden een negatieve controle. Als bijvoorbeeld bereiden buizen bouillon gedurende groei van bacterieculturen niet enten een buis waardoor alleen steriel media. Incubeer het medium langs de geënte buizen te inspecteren dan niet-geënte controle buis op tekenen van verontreiniging, zoals troebelheid van de groei van ongewenste cellen onbedoeld geïntroduceerd in de buis. Indien de controle buis verontreinigd de experimentele buiss kunnen worden ook vervuild en het experiment te herhalen. Deze voorzorgsmaatregelen moeten worden gedaan met elk experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Difco Laboratories	244620	Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	Disinfectant
Ethanol	Fisher Scientific	A406	For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water