Summary
Protokollen beskriver en high-throughput metode til bestemmelse af strukturer af membranproteiner bruge cryo-elektron tomografi og 3D-billedbehandling. Det dækker oplysninger om prøvepræparation, dataindsamling, databehandling og fortolkning, og slutter med produktion af et repræsentativt mål for den tilgang, de HIV-1 Konvolut glycoprotein. Disse beregningsmæssige procedurer er udformet på en måde, der gør det muligt for forskere og studerende til at arbejde eksternt og bidrage til databehandling og strukturel analyse.
Abstract
Siden opdagelsen næsten 30 år siden, har mere end 60 millioner mennesker blevet smittet med human immundefekt virus (HIV) (www.usaid.gov) . Den virus inficerer og ødelægger CD4 + T-celler og dermed lammende immunsystemet, og forårsager en erhvervet immundefekt syndrom (AIDS) 2. Infektion begynder, når hiv Envelope glykoprotein "spike" gør kontakt med CD4 receptoren på overfladen af CD4 + T-celle. Denne interaktion inducerer en konformationelle ændring i spidsen, som fremmer samspil med en anden celle overflade co-receptor 5,9. Betydningen af disse protein interaktioner i HIV-infektion vej gør dem i dyb betydning i grundlæggende HIV-forskning, og i forfølgelsen af en hiv-vaccine.
Behovet for bedre at forstå de molekylære skala interaktioner mellem HIV-celle kontakt og neutralisering motiveret udviklingen af en teknik til at bestemmestrukturer af HIV-spike interagere med celle overflade receptor proteiner og molekyler, der blokerer infektion. Brug cryo-elektron tomografi og 3D-billedbehandling, vi for nylig demonstreret evne til at afgøre sådanne strukturer på overfladen af indfødte virus, ~ 20 en opløsning 9,14. Denne fremgangsmåde er ikke blot at løse hiv Konvolut strukturer, og kan udvides til andre virale membranproteiner og proteiner rekonstitueres på et liposom. I denne protokol, beskriver vi, hvordan du kan få strukturer af HIV kuvert glycoproteiner fra renset hiv virioner og fortsætter trinvis gennem forberede forglasset prøver, indsamling, cryo-elektronmikroskopi data, rekonstitution og behandling af 3D datamængder, udjævning og klassificere 3D protein subvolumes, og fortolkning af resultater for at producere et protein model. Den beregningsmæssige aspekter af vores tilgang er blevet tilpasset i moduler, der er tilgængelige og kan udføres via fjernadgang med Biowulf GNU / Linux parallelt pEHANDLING klynge på NIH (http://biowulf.nih.gov) . Dette fjernadgang, kombineret med lave omkostninger computer hardware og high-speed adgang til nettet, har gjort det muligt inddragelse af forskere og studerende, der arbejder fra skole eller hjem.
Protocol
Den fremgangsmåde, der beskrives her var udviklet ved hjælp af et bestemt sæt af instrumenter, værktøjer og software. Fordi alle Labs ikke vil blive benyttet de samme forsøgsopstilling, blev gjort meget for at generalisere den tilgang, hvor det er muligt, og give alternativer, hvor dette ikke var muligt.
1. Forberedelse forglasset virus prøver
I det følgende afsnit forglasset net er udarbejdet ved hjælp af FEI Vitrobot Mark III, en blotting og springet frysning robot. Se Iancu, et al. For en detaljeret protokol om at bruge dette system 7. Som et alternativ til en robot stempel, er en guillotine-stil eller tyngdekraften stemplet perfekt tilstrækkeligt 6.
I afsnit 1.2. og 1,3. en Gatan Solarus 950 Glimudladningsmassespektrometre enhed bruges til at rense prøve net og øge deres hydrophilicity, selvom enhver Glimudladningsmassespektrometre apparat beregnet til brug sammen med elektronmikroskopi net kan erstattes.
indhold "> Selvom mængden af prøvevolumen anvendes på nettet, før blotting og styrte frysning skal være i intervallet 2 μL, vil virus og protein-A Guld kolloid volumen i prøven blandingen varierer afhængigt af kilden. Som sådan, er det sandsynligt, at en række af virus og guld fortyndinger eller nøgletal bliver nødt til at blive testet og filmede i mikroskopet, og en ideel blanding bestemmes empirisk. Bemærk, at når billedet data er erhvervet i § 3, mellem 10 og 20 guld fiducial markører skal være til stede for korrekt tilt-serien justering.Advarsel: Dette afsnit beskriver brugen af gasformig ethan, brint og ilt, som er meget brandfarlige. Korrekt bør udvises forsigtighed ved brug af disse gasser. Derudover bør det sikres at håndtere virus prøver i overensstemmelse med biosikkerhed anbefalinger. Endelig altid bære beskyttende briller og tøj, når du håndterer flydende nitrogen (N 2) og ethan.
- Forbered FEI Vitrobot MarkIII ved at tænde sin N 2 gasforsyning, installation fugteren patron og derefter fylde patronen med filtreret demineraliseret vand. Tænd Vitrobot og sæt dens klimakammer temperatur til 22 ° C, målet luftfugtighed på 100%, blotting tid til 6 sek, og duppes offset til -2 mm.
- Tænd for Gatan Solarus 950 Glimudladningsmassespektrometre enhed og åbner H 2 og O 2 dunke, der forsyner enheden. Pre-clean prøvekammer ved at køre glød decharge for 1 minut ved 50 watt.
- Arranger det ønskede antal Holey kulstof gitre på et dækglas, kul opad, og sted inde Glimudladningsmassespektrometre prøvekammer gennem toppen lågen. Rengør gitre ved at køre Glimudladningsmassespektrometre i 6-10 sek ved 25 watt. (Bemærk, at kulstof side af Quantifoil mærke gitre anvendes i denne protokol er mat i udseendet. Dette vil ikke være sandt for alle kommercielle net, så det er bedst at indhente disse oplysninger fra producenten.)
- Placér gitter kasse (r) inde kurreLant container skål, og termisk diffuser spindel på den centrale koppen, der sidder inden for kølervæske skål. Langsomt hælde væske N 2 i skålen, indtil kraftige boblende aftager, hvilket tyder på ligevægt mellem skål og væske. Bevar flydende N 2-niveau i hele den resterende del af proceduren, idet man holde det ud af centrale kop.
- Sæt den ene ende af en plastik slange til ethan gas beholder, og den anden ende til et glas pipette. Hold glaspipette tip til bunden af det centrale kop, oprette et langsomt, roligt ethan flow, og ethan vil begynde kondenserende. Fortsæt med at udfylde, indtil den centrale koppen er fuld. Fjern spindlen fra det centrale kop.
- Forbered prøven blanding ved tilsætning af 2 μL protein-A Guld kolloid fiducial til 10 μL AT-2 inaktiveret HIV-1-virus suspension. Forsigtigt pipette blanding at bringe fiducials i opløsning. Hold på is.
- Tag fat i den yderste kant af et gitter med de specialiserede Vitrobot pincet. Påfør 2 μL af prøven blanding til carbon side af nettet. Umiddelbart instruere robotten til at indlæse prøven i fugtet klimakammer, duppes og styrte fryse i flydende ethan.
- Overførsel forglasset gitter til gitter boks. Gentag trin 1.7. til at producere det ønskede antal net. Når du er færdig, stramme skruerne på nettet æskens låg (r) så hurtigt overføre kasse (r) til små flydende nitrogen transport Dewar.
2. Isætning af prøver i transmissions elektron mikroskop
I hele dette afsnit, skal den flydende N 2-niveau i læsning afdeling, der skal overvåges årvågent, og flydende suppleres efter behov, for at sikre, at nettet kasser fortsat er nedsænket. Før bringe et værktøj i kontakt med et gitter, afkøles ved at placere den i flydende N 2, indtil det equilibrates med væsken. Efter hver brug skal redskaber være afrimes ved hjælp af en varm luft pistol.
I hele dette afsnit FEI Tecnai G2 Polara transmissions elektron mikroskop (TEM) bruges sammenmed en Gatan Cryo Workstation. Selv om princippet om isætning af prøver i flydende N 2 betingelser er gældende for alle cryo-elektronmikroskopi arbejde, trinene i dette afsnit er specifikke for udstyr, der anvendes i eksperimentet. De trin, der anvendes til forskelligt udstyr, vil variere fra producent.
FORSIGTIG: I hele dette afsnit, brug altid beskyttelsesbriller og tøj, når du håndterer flydende N 2.
- Sørg for, at TEM Compustage ikke indeholder en prøve patron, og at prøven valg stang og indsættelse stang er under 110 K.
- Cool og forberede Cryo Workstation for ilægning af net til præparatopbevarings-blok, som er en del af stikprøveudvælgelsen stang.
- Overfør afkølet (<110 K) valg stang fra mikroskop til Cryo Workstation.
- Slide valg stang frem til at indsætte udvalg blokere til kvælstof bad på Cryo Workstation. Fjern alle eksemplar patroner fra lageret blokere ved hjælp af specialiseret cartridge-håndtering pincet. Placér gitter kasse (r) i lastning arbejdsstation og løsne låget (r) med en skruetrækker.
- Brug en pincet til at fjerne gitteret fra nettet boks og plads i patronen. Brug den specialiserede C-klip placering værktøj til at deponere en C-klip på toppen af nettet, sikring af nettet i patronen.
- Gentag trin 2.5. indtil det ønskede antal gitre er i kassetter. Overførsel patroner til prøven valg blok.
- Forbered Cryo Workstation til fjernelse af prøven valg stang. Skub valg Rod tilbage at fjerne markeringen blok fra kvælstof bad. Fjern markering stang fra Cryo Workstation og tillægger TEM.
3. Erhvervelse af kryo-elektronmikroskopi data
Under dette afsnit, er FEI Batch Tomography software interface bruges til at oprette en batch-fil, der gemmer koordinaterne for alle grid positioner af interesse. Når instrueret af brugeren, vil Batch Tomography software gense hver af de positioner og vil koordineretilt-serien købet via Digital mikrograf. Hvis denne software ikke er tilgængelig, Leginon softwarepakke er levedygtigt gratis, open source-alternativ 13. Imaging blev gjort ved 200 keV, ved hjælp af en Gatan Imaging Filter (GIF) med en post-GIF 2K x 2K CCD kamera (Gatan).
- Position Compustage sådan, at elektronstrålen passerer gennem vakuum. Skift til høj forstørrelse (34kX) Exposure Mode og udføre direkte alignments.
- Juster nul tab peak på energi-filter. (Dette giver den energi filter med en reference for elektroner med nul energi tab.)
- Flyt Compustage til et netområde byder kulstof. I lav forstørrelse (4.5kX) Søgetilstand, skal du bruge Wobbler funktionen til at vippe scenen frem og tilbage mellem + / -15 °. I mellemtiden justere Z-aksen fase position, indtil minimal fase skift er observeret. (Dette placerer scenen omkring kl eucentric højde). Deaktiver Wobbler når intet tidspunkt skift er observeret.
- Brug den automatiske Eucentric Højde f Salvelse at forfine eucentric højde. (Denne rutine bruger tværs sammenhæng for at opnå en mere præcis eucentric højde end i trin 3.3). Eucentric højden gemmes automatisk til senere brug ved Batch Tomography software.
- Find et område af interesse byder på ca 3-6 virioner, og ikke mindre end ti fiducial markører. Tilføj dette gitter position til batch tomografi fil.
- Gentag trin 3.4. og 3,5. indtil det ønskede antal stillinger er udpeget. Definer batch parametre (± 60 ° med 2 ° tilt intervaller, 1-2 e-/ A 2 / tilt view) og kør batch.
4. Rekonstruere cryo-elektron tomogrammer
- Juster tilt-serien ved hjælp af automatiske fiducial-baserede tilpasningen på RAPTOR 1.
- Rekonstruere tomogrammer med R-vægtede back projektion i against 8. Den standard filformat til de resulterende data mængder er MRC-fil med filtypenavnet. MRC.
I dette afsnit bruger en tilpasset forlængelse af against som tillader brugeren at udpege virion subvolumes inden for tomogram. I § 6, er den brugerdefinerede virion grænser brugt som en overflade, langs hvilken spikes er automatisk valgt.
- Åbn against og indlæse en tomogram befolket med virioner.
- Naviger langs Z-aksen af tomogram indtil den centrale skive gennem en af de virioner er placeret. Kontroller, at virion geometriske tyngdepunkt er blevet identificeret. Efter at gøre det, deponere en virion markør. Denne markør vil blive brugt af det automatiske virion segmentering nytte i § 6.
- Fortsæt tyngdepunkt betegnelse, indtil alle virion mængder er identificeret.
- Luk tomogram og gem markør satte ved fastlæggelsen af virion centroids. Gentag indtil virioner er blevet udpeget i alle tomogrammer.
- Brug against, ned-sample virion subtomograms med en faktor fire.
- Tilføjes et vandmærke virioner med EDGE-styrke anisotropisk diffusion som implementeret i against.
- Med forbehold virioner ukontrollerede membran segmentering ved hjælp af en energi-baserede tre-dimensionelle tilgang (se nærmere i Bartesaghi et al. 2005) 3.
- Spikes er identificeret på steder på segmenterede virion overflader, der svarer til den lokale maksima af grænseoverskridende korrelation mellem den særlige beliggenhed og en syntetisk symmetrisk spike-lignende volumen. De steder over en fastsat grænse føjes til en liste over koordinater for formodede spike subvolumes.
6. Klassificering og gennemsnittet af partikler
- Beregningsmæssigt pakke tomogram subvolumes (100 x 100 x 100 voxels) på hvert sted, der blev identificeret i trin 5.8. (Dette sker uden denoising eller binning). Den resulterende samling af subvolumes indeholder spike proteiner, der vil blive klassificeret, og gennemsnit i de følgende trin.
- Determine retningslinjerne fra den lange akse i spidsen ved hjælp af normale til de automatisk segmenterede membranen på placeringen af hver spike. Denne fremgangsmåde giver oprindelige overslag for to af de tre Euler vinkler.
- Tilfældig de resterende in-sted rotation for at forhindre enhver mulig skævhed i de efterfølgende justeringer.
- Anvend Euler vinkler til subvolumes, så translationally justere subvolumes til deres cylindrisk gennemsnit globale gennemsnit for at sikre, at de alle deler den samme centrum masse.
- Fjern de 10% af subvolumes der korrelerer dårligst med den opdaterede globale gennemsnit. Dette gøres for at fjerne tætheder har størst risiko for at blive fejlagtigt identificeret pigge.
- Juster og klassificere spike mængder uden brug af eksterne referencer og med korrekt bogføring af den manglende kile (se nærmere i Bartesaghi et al. 2008) 4. Gradvist forfine subvolume alignments og klassificere spike mængder ved hver iteration.
- Tre-dobbelt symmetri skal klart iagttages i de tidlige stadier af klassificering, og på den fjerde iteration, er 3-dobbelt symmetri pålagt. Ved hver runde, er de mest veldefinerede klasser udlignes og bruges som reference for den næste runde.
- Typisk ~ 4000 pigge skal vælges for hvert datasæt. Final density kort opnås efter ~ 5-12 raffinement runder, og vil indeholde bidrag fra ~ 50% af sub-mængder i de enkelte datasæt.
7. Koordinere montering
- Tætheden kort som følge af trin 6,8 åbnes i UCSF Chimera 12.
- Fremstil en simuleret 20 a kort af X-ray koordinater ved hjælp af Chimera eller EMAN 10.
- Dock koordinater ind i tilfældige retninger. Brug af Chimera er bygget i stejleste-opstigning lokale optimering, koordinerer fit ved at udføre multiplum af 100 stejleste opstigning trin, indtil konvergens opnås.
8. Repræsentative resultater
Ved hjælp af 3D-gennemsnit og koordinere montering, en række HIV-og SIV Env spike strukturer er blevet løst. Præsenteret i figur 3A er strukturen af konvolutten spike fra HIV-1 stamme, BAL (lilla). Spidsen har tre gange symmetri med dimensioner på ~ 120 Å målt fra membran til spike apex, og en maksimal bredde på ~ 150 Å, som vokslys ned til ~ 35 A ved bunden af spike. Som det fremgår af figur 3B, ved at kombinere tætheden kortet for trimeriske Env bestemmes ved hjælp af cryo-elektron tomografi med crystallographically bestemt struktur for monomere gp120 (rød, stammer fra FBF ID, 2NY7), vi var i stand til at opnå en arbejdsgruppe molekylære model for trimeriske kuvert glykoprotein kompleks (FBF ID, 3DNN) 9.
Vores tilgang gør det også muligt for den strukturelle analyse af komplekser dannet mellem trimeriske ENV og en bred vifte af gp120-specifikke proteinfragmenter og antistoffer. Et eksempel på dette, hvor Env er kompleks med bredt neutraliserende B12 Fab er vist i figur 4A (hele komplekset er vist i lilla). I dette tal, er den ekstra tæthed svarende til B12 set projicere udad fra spidsen, og parallelt med membranen. Strukturelle fortolkninger af disse komplekser kan udvides til det molekylære niveau ved montering tætheden kort med atomare koordinater for dele af spike, bundet til den tilsvarende ligand. Som det fremgår af figur 4B, når denne tæthed kort er udstyret med koordinater gp120 spike protein (rød, stammer fra FBF ID, 2NY7) bundet af B12 Fab (hvid), den relative orientering af de tre gp120 kerner kan konstateres (FBF ID, 3DNL). Disse konformationelle relationer er lærerigt for at forstå, hvordan sådanne ligander interagerer med spike og forstyrre virusaktivitet. Nogle andre strukturer unliganded og liganded Env, der er blevet løst ved hjælp af metoden præsenteres her inklUde dem af HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S og SIVmac239, det ternære kompleks mellem hiv-1 Bal Env, sCD4 og 17b Fab, og SIV CP-Mac Env kompleksbundet til 7D3 antistof 9,14.
Figur 1 Fra viral suspension til 3D-struktur:. Konceptuelle trin i cryo-elektron-mikroskopi og 3D-rekonstruktion.
Figur 2. (A) En repræsentant skive fra en tomogram af HIV-1 virioner. (B) En enkelt HIV-1 virion, med kernen og overfladen pigge vist skematisk.
Figur 3. (A) Tre-dimensionelle struktur af HIV-1 Bal Konvolut glykoprotein (overflade pigge), som vises på overfladen af den virale membranen. (B) Molekylær model for trimeRIC spikes bestemmes ved at placere tre eksemplarer af strukturerne for monomere gp120 (rød) afledt af X-ray krystallografi ind i tætheden kortet 9.
Figur 4. (A) Tre-dimensionelle struktur af HIV-1-BAL Konvolut glycoprotein i kompleks med Fab-fragment af en bredt neutraliserende antistoffer, B12. (B) Molekylær model for de komplekse bestemmes ved at placere tre eksemplarer af strukturerne for monomere gp120-B12 Fab kompleks afledt af X-ray krystallografi ind i tætheden kortet 9.
Discussion
Den kryo-elektronmikroskopi og tre-dimensionelle klassificering og gennemsnit metoder, der præsenteres her, giver mulighed for bestemmelse af tre-dimensionelle strukturer af konvolutten glycoprotein komplekser til ~ 20 a opløsning. Montering af X-ray koordinater for monomere komponenter til tætheden kort giver mulighed for strukturelle tolkning på det molekylære niveau. Fortsat forbedringer i lavpris-computing udstyr kombineret med udviklingen i open source videnskabelige redskaber og spredning af infrastrukturen muliggør tidligere utænkelige videnskabelige kollaborativ indsats. Vi tager fordel af denne udvikling og viser, at avancerede videnskabelige teknikker, der kan anlægges inden for rækkevidde af studerende i mange aldre.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker biologiske produkter sektion af AIDS og kræft virus program, SAIC Frederick, Inc, for at levere renset, AT-2 behandlede HIV-1 virus, Steven Fellini og kolleger for at få hjælp med brug af højtydende beregningsmæssige muligheder for Biowulf Linux-klynge på NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI Company for hjælp med elektronmikroskopi, og Ethan Tyler til sagkyndig bistand med tal. Dette arbejde blev støttet af midler fra Center for Cancer Research på National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
