Summary
Protokollen beskriver en high-throughput tilnærming til å avgjøre strukturer av membran proteiner ved hjelp av Cryo-elektron-tomografi og 3D bildebehandling. Den dekker detaljene i prøven forberedelser, datainnsamling, databehandling og tolkning, og konkluderer med produksjon av en representant mål for tilnærming, HIV-1 konvolutt glykoprotein. Disse beregningsorientert prosedyrer er utformet på en måte som gjør at forskere og studenter til å jobbe eksternt og bidra til databehandling og strukturell analyse.
Abstract
Siden den ble oppdaget nesten 30 år siden, har mer enn 60 millioner mennesker blitt smittet med humant immunsviktvirus (HIV) (www.usaid.gov) . Viruset infiserer og ødelegger CD4 + T-celler og dermed ødeleggende det immunsystem, og forårsaker en ervervet immunsvikt syndrom (AIDS) 2. Infeksjon begynner når HIV Envelope glykoprotein "spike" gjør kontakt med CD4-reseptoren på overflaten av CD4 + T-celle. Dette samspillet induserer en konformasjonsendring i spissen, som fremmer samhandling med andre cellen overflate co-reseptor 5,9. Betydningen av disse protein interaksjoner i HIV-infeksjonen vei gjør dem av dyptgripende betydning i grunnleggende HIV-forskning, og i jakten på en HIV-vaksine.
Behovet for å bedre forstå de molekylære skala interaksjoner av HIV-celle kontakt og nøytralisering motivert utviklingen av en teknikk for å bestemmestrukturer av HIV pigg i samspill med celleoverflaten reseptor proteiner og molekyler som blokkerer infeksjon. Ved hjelp av Cryo-elektron-tomografi og 3D bildebehandling, vi nylig vist evne til å avgjøre slike strukturer på overflaten av innfødte virus, på ~ 20 en oppløsning 9,14. Denne tilnærmingen er ikke begrenset til å løse HIV Konvolutt strukturer, og kan utvides til andre viral membran proteiner og proteiner rekonstituert på en liposome. I denne protokollen beskriver vi hvordan du får tak strukturer av HIV konvolutt glykoproteiner start fra renset HIV virioner og går trinnvis gjennom forbereder vitrified prøver, innsamling, Cryo-elektron mikroskopi data, rekonstituering og bearbeiding av 3D data volumer, snitt og klassifisering 3D protein subvolumes, og tolke resultatene for å produsere et protein modell. Den beregningsorientert aspekter av vår tilnærming var tilpasset inn i moduler som kan åpnes og kjøres eksternt ved hjelp av Biowulf GNU / Linux parallell pBearbeiding klynge ved NIH (http://biowulf.nih.gov) . Dette ekstern tilgang, kombinert med lave kostnader maskinvare og high-speed nettverkstilgang, har gjort mulig involvering av forskere og studenter som arbeider fra skolen eller hjemme.
Protocol
Tilnærmingen som beskrives her, ble utviklet ved hjelp av et bestemt sett av instrumenter, verktøy og programvare. Fordi alle laboratorier ikke skal bruke dette samme eksperimentelle oppsettet, ble forsøk gjort for å generalisere tilnærmingen der det er mulig, og tilbyr alternativer der dette ikke var mulig.
1. Forbereder vitrified virus samples
I det følgende avsnittet vitrified nett er utarbeidet etter den FEI Vitrobot Mark III, en blotting og stuper frysing robot. Se Iancu, et al. For en detaljert protokoll om bruk dette systemet syv. Som et alternativ til en robot-stempelet, er en giljotin-stil eller tyngdekraften stempelet perfekt tilstrekkelig 6.
I § 1.2. og 1.3. en Gatan Solarus 950 glød utflod enhet brukes til å rense prøve nett og øke deres hydrophilicity, skjønt noen glød utslipp enhet designet for bruk med elektron mikroskopi nett kan erstattes.
innhold "> Selv om mengden av prøvevolum brukt til nettet før blotting og stupe frysing bør være i størrelsesorden 2 mL, vil viruset og protein-A gull kolloid volum i prøven blandingen varierer avhengig av kilden. Som sådan, det er sannsynlig at en rekke virus og gull fortynninger eller forholdstall må være testet og avbildet i mikroskop, og en ideell blanding bestemmes empirisk. Merk at når bildedata er ervervet i § 3, mellom 10 og 20 gull fiducial markører bør være tilstede for riktig tilt serien justering.Advarsel: Denne delen beskriver bruk av gass etan, hydrogen og oksygen som er svært brannfarlig. Riktig forsiktighet bør utvises ved bruk av disse gassene. I tillegg bør man sørge for å håndtere virus prøver i henhold til biosikkerhet anbefalinger. Til slutt, alltid bruke vernebriller og verneklær ved håndtering av flytende nitrogen (N 2) og etan.
- Forbered FEI Vitrobot MarkIII ved å slå på sin N 2 gassforsyning, installere luftfukteren patronen og fylle kassetten med filtrert avionisert vann. Strøm på Vitrobot og sette klimakammer temperaturen til 22 ° C, target fuktighet til 100%, blotting tid til 6 sek, og blot offset til -2 mm.
- Slå på Gatan Solarus 950 glød utflod enhet og åpne H 2 og O 2 beholdere som leverer enheten. Pre-clean prøve kammer ved å kjøre glød utflod i 1 min ved 50 watt.
- Ordne ønsket antall holey karbon nett på et glass dekkglass, karbon siden opp og sted inne glød utflod prøven kammer gjennom toppen ileggsdøren. Clean nett ved å kjøre glød utslipp for 6-10 sek ved 25 Watt. (Merk at karbon siden av Quantifoil merkevaren nett som brukes i denne protokollen er matt i utseende. Dette vil ikke være sant for alle kommersielle nett så det er best å få denne informasjonen fra produsenten.)
- Plasser grid boks (es) inne COOLant container bolle, og termisk diffuser spindel på den sentrale kopp som sitter i kjølevæsken bolle. Sakte hell væske N 2 i bollen til livskraftige boblende avtar, noe som indikerer likevekt mellom bolle og væske. Oppretthold væske N 2 nivå gjennom resten av prosedyren, ta vare å holde den ut av sentrale koppen.
- Fest den ene enden av en plastslange til etan gass-beholderen, og den andre enden til et glass pipette. Hold glass pipettespissen til bunnen av sentrale cup, etablere en langsom, jevn etan flow, og etan vil begynne kondenserende. Fortsett å fylle til sentrale koppen er full. Fjern spindel fra sentrale kopp.
- Forbered prøve blanding ved å tilsette 2 mL protein-A gull kolloid fiducial til 10 mL AT-2 inaktiverte HIV-1 viruset suspensjon. Forsiktig pipette blandingen å bringe fiducials inn i løsningen. Hold på is.
- Ta tak i ytre kanten av et rutenett med spesialiserte Vitrobot pinsett. Påfør 2 mL av prøven blandingen til karbon eride av nettet. Umiddelbart instruere robot å laste prøven i fuktet klimakammer, blot og stuper fryse i flytende etan.
- Transfer vitrified rutenett til rutenett boksen. Gjenta steg 1.7. å produsere ønsket antall rutenett. Når du er ferdig, stram skruene på grid boks lokket (e) så raskt overføre boksen (e) på små flytende nitrogen transport Dewar.
2. Lastet inn prøver til overføring elektronmikroskop
Gjennom denne delen, bør væsken N 2-nivået i lasting kammer overvåkes vigilantly, og flytende etterfylt etter behov, for å sikre at nettet boksene forblir nedsenket. Før bringe et verktøy i kontakt med et rutenett, kjøle den ved å senke den i flytende N 2 inntil den equilibrates med væsken. Etter hver bruk, bør verktøy tines ved hjelp av en varmluftpistol.
Gjennom denne delen av FEI Tecnai G2 Polara overføring elektronmikroskop (TEM) er brukt i forbindelsemed en Gatan Cryo arbeidsstasjon. Mens prinsippet om lasting prøvene under flytende N 2 betingelsene gjelder for alle Cryo-elektron mikroskopi arbeid, trinnene i dette avsnittet er spesifikke for utstyr som brukes i forsøket. Trinnene brukes til forskjellig utstyr vil variere fra produsenten.
ADVARSEL: I denne delen alltid Bruk vernebriller og verneklær ved håndtering av flytende N 2.
- Sikre at TEM Compustage ikke inneholder en prøve patron, og at prøven utvalg stang og innsetting stang er under 110 K.
- Cool og forberede Cryo arbeidsstasjon for lasting nett til oppbevaring blokk, som er en del av prøven utvalg stang.
- Overfør den avkjølte (<110 K) utvalg stang fra mikroskop for å Cryo Workstation.
- Slide utvalg stang frem til å sette utvalg blokk i nitrogen bath på Cryo Workstation. Fjern alle prøver patroner fra lagring blokken ved hjelp av spesialiserte cartridge-håndtering tang. Plasser grid boks (es) i lasting arbeidsstasjon og løsne lokket (s) med en skrutrekker.
- Bruk pinsett til å fjerne nett fra grid boks og plass i kassett. Bruk spesialiserte C-clip plassering verktøy for å sette en C-klipp på toppen av grid, sikre rutenett i kassetten.
- Gjenta steg 2.5. inntil ønsket antall grid er i kassetter. Transfer patroner til prøven utvalg blokk.
- Forbered Cryo Workstation for fjerning av prøven utvalg stang. Skyv utvalg stang tilbake for å fjerne utvalg blokken fra nitrogen bad. Fjern avgrensning stang fra Cryo Workstation og fest til TEM.
3. Innhente Cryo-elektron mikroskopi data
Under denne delen, er FEI Batch Tomography programvare grensesnitt som brukes til å sette opp en batch fil som lagrer koordinatene til alle grid posisjoner av interesse. Når instruert av brukeren, vil Batch Tomography programvaren tilbake hver av stillingene, og vil koordineretilt serie oppkjøp via Digital micrograph. Hvis denne programvaren ikke er tilgjengelig, er Leginon programvarepakke levedyktig gratis, åpen kildekode-alternativ 13. Imaging ble gjort på 200 keV, ved hjelp av en Gatan Imaging Filter (GIF) med en post-GIF 2K x 2K CCD kamera (Gatan).
- Plasser Compustage slik at elektronstrålen passerer gjennom vakuum. Bytt til høy forstørrelse (34kX) Eksponering Mode og utføre direkte justeringer.
- Align null tap peak på energi filter. (Dette gir energi filteret med en referanse for elektroner med null energi tap.)
- Flytt Compustage til et rutenett område med karbon. I lav forstørrelse (4.5kX) Search Mode, bruker Wobbler funksjonen for å vippe scenen frem og tilbake mellom + / -15 °. Samtidig justerer Z-aksen scenen stillingen inntil minimal scenen skiftet er observert. (Dette posisjoner scenen omtrent på eucentric høyde). Deaktiver Wobbler når ingen scenen skiftet er observert.
- Bruk automatiserte Eucentric Høyde f salvelse å forbedre eucentric høyde. (Denne rutinen bruker kryss sammenheng for å få en mer nøyaktig eucentric høyde enn i trinn 3.3). Eucentric høyde er automatisk lagret for senere bruk av Batch Tomography programvare.
- Finn et område av interesse med ca 05:57 virioner, og ikke mindre enn ti fiducial markører. Legg dette rutenettet posisjon til batch tomografi fil.
- Gjenta trinn 3.4. og 3.5. inntil ønsket antall stillinger er utpekt. Definer batch parametere (± 60 ° med 2 ° tilt trinn, 1-2 e-/ A 2 / tilt utsikt) og kjøre batch.
Fire. Rekonstruere Cryo-elektron tomograms
- Align tilt serien ved hjelp av automatisk fiducial-baserte justering i RAPTOR 1.
- Rekonstruere tomograms bruker R-vektet tilbake projeksjon i IMOD 8. Standard filformat for den resulterende datamengder er MRC-fil, med filendelse. MRC.
Denne delen bruker en tilpasset utvidelse av IMOD som tillater brukeren å utpeke virion subvolumes innenfor tomogram. I § 6, er brukerens definerte virion grenser brukt som underlag langs hvilke spikes velges automatisk.
- Åpen IMOD og laste et tomogram befolket med virioner.
- Naviger langs Z-aksen av tomogram til sentrale skjære gjennom en av de virioner ligger. Kontroller at virion Tyngdepunktet har blitt identifisert. Etter å ha gjort det, setter en virion markør. Denne markøren vil bli brukt av den automatiserte virion segmentering verktøyet i § 6.
- Fortsett Tyngdepunktet betegnelse inntil alle virion volumer identifiseres.
- Lukk tomogram og lagre markør satt definere virion centroids. Gjenta til virioner har blitt utpekt i alle tomograms.
- Bruk IMOD, down-sample virion subtomograms med en faktor på fire.
- Denoise virioner bruker edge-forsterke anisotrop diffusjon som implementert i IMOD.
- Subject virioner til unsupervised membran segmentering ved hjelp av en energi-basert tre-dimensjonale tilnærming (detaljert i Bartesaghi et al. 2005) 3.
- Spikes er identifisert på steder på det segmenterte virion flater tilsvarende lokale maksima av kryss sammenheng mellom bestemt sted og en syntetisk symmetrisk pigg-lignende volum. De steder over en spesifisert terskel legges til en liste over koordinater for mulige spike subvolumes.
Seks. Klassifisering og gjennomsnitt partiklene
- Beregningsmessig pakke ut tomogram subvolumes (100 x 100 x 100 voxels) på hvert sted som ble identifisert i trinn 5.8. (Dette gjøres uten denoising eller Binning). Den resulterende samling av subvolumes inneholde spike proteinene som vil bli klassifisert og i gjennomsnitt i de følgende trinn.
- Determine det orientering av den lange aksen av pigg bruke normal til automatisk segmenterte membranen på plasseringen av hver spike. Denne tilnærmingen gir første estimatene for to av de tre Euler vinkler.
- Randomize det resterende i-plass rotasjon for å forhindre eventuelle skjevheter i senere justeringer.
- Bruk Euler vinkler til subvolumes, deretter translationally justere subvolumes til deres cylindrically gjennomsnitt globale gjennomsnittstemperaturen for å sikre at de deler alle den samme sentrum av masse.
- Fjern 10% av subvolumes som korrelerer mest dårlig med den oppdaterte globale gjennomsnittet. Dette gjøres for å fjerne tettheter i størst fare for å bli feilaktig identifisert toppene.
- Rett og klassifisere spike volumer uten å bruke eksterne referanser og med riktig regnskapsføring av de savnede kile (detaljert i Bartesaghi et al. 2008) 4. Progressivt avgrense subvolume justeringer og klassifisere pigg volumer på hver iterasjon.
- Tre ganger symmetri bør være tydelig observeres i de tidlige stadier av klassifisering, og på den fjerde iterasjon, er 3-fold symmetri pålagt. Ved hver runde, er de mest veldefinerte klasser gjennomsnitt og brukes som referanse for neste runde.
- Vanligvis ~ 4000 pigger bør velges for hvert datasett. Endelig tetthet kartene oppnås etter ~ 5-12 raffinement runder og vil omfatte bidrag fra ~ 50% av sub-volumer i hvert datasett.
7. Koordinere montering
- Tettheten kartene resultat fra trinn 6,8 åpnes i UCSF Chimera 12.
- Lag en simulert 20 et kart av X-ray koordinater ved hjelp Chimera eller EMAN 10.
- Dock koordinatene til tilfeldig orientering. Bruk Chimera er bygget i bratteste-oppstigning lokale optimalisering, passform koordinater ved å utføre multipler av 100 bratteste oppstigningen trinnene til konvergens er oppnådd.
8. Representant Resultater
Ved hjelp av 3D-snitt og koordinere montering, et utvalg av hiv og SIV Env spike strukturer har blitt løst. Presentert i figur 3A er strukturen av konvolutten pigg fra HIV-1 stamme, BAL (lilla). Den spike har tre ganger symmetri med dimensjoner på ~ 120 A målt fra membranen til pigg apex, og en maksimal bredde på ~ 150 A som smalner ned til ~ 35 A ved bunnen av spike. Som sett i Figur 3B, ved å kombinere tettheten kartet for trimeric Env bestemmes ved hjelp av Cryo-elektron tomografi med crystallographically bestemt struktur for monomere gp120 (rød, avledet fra PDB ID, 2NY7), klarte vi å få en fungerende molekylær modell for trimeric konvolutt glykoprotein kompleks (PDB ID, 3DNN) 9.
Vår tilnærming gjør det også mulig for den strukturelle analysen av komplekser dannet mellom trimeric Env og en rekke gp120-spesifikke proteinfragmenter og antistoffer. Et eksempel på dette, der Env er kompleksbundet med bredt nøytralisere B12 Fab er vist i figur 4A (hele komplekset er vist i lilla). I denne figuren er det ekstra tetthet tilsvarende B12 sett stikker utover fra pigg, og parallelt med membranen. Strukturelle tolkninger av slike komplekser kan utvides til molekylært nivå ved å montere den tetthet kartene med atom-koordinater for deler av spike, bundet til tilsvarende ligand. Som sett i 4B figur, når denne tettheten kartet er utstyrt med koordinatene til gp120 spike protein (rød, avledet fra PDB ID, 2NY7) bundet av B12 Fab (hvit), den relative orientering av de tre gp120 kjernene kan discerned (PDB ID, 3DNL). Disse bygningsmessige forholdene er lærerike for å forstå hvordan slike ligander samhandle med spike og forstyrre med virus aktivitet. Noen andre strukturer av unliganded og liganded Env som har blitt løst av metoden presenteres her inkl.ude de av HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S og SIVmac239, den trefoldig kompleks mellom HIV-1 Bal Env, sCD4 og 17b Fab, og SIV CP-Mac Env kompleksbundet til 7D3 antistoff 9,14.
Figur 1 Fra viral suspensjon til 3D-struktur. Konseptuelle trinnene i Cryo-elektron mikroskopi og 3D rekonstruksjon.
Figur 2. (A) En representant skive fra en tomogram av HIV-1 virioner. (B) En enkelt HIV-1 virion, med kjerne og overflate spikes vist skjematisk.
Figur 3. (A) Tredimensjonal struktur av HIV-1 BAL konvolutt glykoprotein (overflate spikes) som vises på overflaten av viral membran. (B) Molekylær modell for trimeric spikes bestemmes ved å plassere tre kopier av strukturer for monomere gp120 (red) avledet av røntgenkrystallografi inn tettheten kartet 9.
Figur 4. (A) Tredimensjonal struktur av HIV-1 BAL konvolutt glykoprotein i kompleks med Fab fragment av en bredt nøytraliserende antistoff, B12. (B) Molekylær modell for komplekse bestemmes ved å plassere tre kopier av strukturer for monomerisk gp120-B12 Fab kompleks utledet ved røntgenkrystallografi inn tettheten kartet 9.
Discussion
Den Cryo-elektron mikroskopi og tre-dimensjonale klassifisering og gjennomsnitt metoder presenteres her gir mulighet for fastsettelse av tre-dimensjonale strukturer av konvolutt glykoprotein komplekser til ~ 20 A oppløsning. Montering av X-ray koordinatene til monomere komponenter til tetthet kartene gjør det mulig for strukturell tolkning på molekylært nivå. Fortsetter forbedringer i lavkostland datautstyr kombinert med utviklingen i open source vitenskapelige verktøy og spredning av nettverksinfrastruktur muliggjøre tidligere utenkelige vitenskapelig samarbeid bestrebelser. Vi tar nytte av denne utviklingen og viser at avanserte vitenskapelige teknikker kan bringes innenfor rekkevidde av studenter i mange aldre.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker biologiske produkter Seksjon for AIDS og kreft virus program, SAIC Frederick, Inc, for å gi renset, AT-2 behandlet HIV-1 virus, Steven Fellini og kollegaer for hjelp med bruk av høy-ytelse beregningsorientert evner av Biowulf Linux cluster ved NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI Company for assistanse med elektronmikroskopi, og Ethan Tyler for sakkyndig bistand med tall. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Center for Cancer Research ved National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
