Summary
प्रोटोकॉल के एक उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का उपयोग क्रायो - इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और 3 डी इमेज प्रोसेसिंग के ढांचे का निर्धारण दृष्टिकोण का वर्णन करता है. यह नमूना तैयारी के विवरण, डाटा संग्रह, डाटा प्रोसेसिंग और व्याख्या को शामिल किया गया है, और दृष्टिकोण, एचआईवी -1 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के लिए एक प्रतिनिधि लक्ष्य के उत्पादन के साथ समाप्त. इन कम्प्यूटेशनल प्रक्रियाओं के लिए एक तरीका है कि छात्रों और शोधकर्ताओं के लिए सक्षम बनाता दूर से काम करने के लिए और डाटा प्रोसेसिंग और संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए योगदान में डिजाइन किए हैं.
Protocol
यहाँ वर्णित दृष्टिकोण उपकरणों, उपकरण, और सॉफ्टवेयर का एक विशिष्ट सेट का उपयोग कर विकसित किया गया था. क्योंकि सभी प्रयोगशालाओं इस एक ही प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग नहीं होगा, प्रयास करने के लिए दृष्टिकोण सामान्यीकरण जहां संभव हो, और जहां यह संभव नहीं था विकल्प प्रदान करने के लिए बनाया गया था.
1. Vitrified वायरस के नमूने की तैयारी
निम्न अनुभाग में vitrified ग्रिड फी Vitrobot मार्क III, सोख्ता और डुबकी ठंड रोबोट का उपयोग करने के लिए तैयार हैं. यह 7 प्रणाली का उपयोग करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए Iancu, एट अल. देखें . एक रोबोट सवार के लिए एक विकल्प के रूप में, एक गिलोटिन शैली या गुरुत्वाकर्षण सवार पूरी तरह से पर्याप्त है 6.
1.2 धारा. और 1.3. Gatan Solarus 950 चमक निर्वहन इकाई नमूना ग्रिड को साफ करने और उनके hydrophilicity में वृद्धि करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि किसी भी चमक निर्वहन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के साथ प्रयोग के लिए डिजाइन उपकरण प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
सामग्री "> हालांकि सोख्ता और डुबकी ठंड से पहले ग्रिड के लिए लागू नमूना मात्रा की राशि 2 μL की सीमा में होना चाहिए, और नमूना मिश्रण में प्रोटीन एक सोने colloid मात्रा वायरस स्रोत के आधार पर भिन्न हो जाएगा. जैसे, यह संभावना है कि वायरस और सोने dilutions या अनुपात की एक श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए और माइक्रोस्कोप में imaged होगा, और एक आदर्श मिश्रण empirically निर्धारित .. नोट है कि जब छवि डेटा धारा 3 में अधिग्रहण कर लिया है 10 और 20 के बीच, सोने मापकला मार्करों चाहिए उचित झुकाव श्रृंखला संरेखण के लिए उपस्थित हो.चेतावनी: इस अनुभाग में गैसीय एटैन, हाइड्रोजन और ऑक्सीजन के उपयोग का वर्णन करता है जो अत्यधिक ज्वलनशील हैं. उचित सावधानी जब इन गैसों का उपयोग कर लिया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, देखभाल करने के लिए जैव सुरक्षा सिफारिशों के अनुसार में वायरस के नमूने को संभाल लिया जाना चाहिए. अंत में, हमेशा सुरक्षात्मक eyewear और कपड़े पहन जब तरल नाइट्रोजन (एन 2) और एटैन से निपटने .
- फी Vitrobot मार्क तैयारइसकी N 2 गैस की आपूर्ति पर मोड़, humidifier कारतूस स्थापित करने और फिर फ़िल्टर विआयनीकृत जल के साथ कारतूस भरने के द्वारा III. Vitrobot पर पावर और 22 के लिए अपनी जलवायु चैम्बर तापमान सेट डिग्री सेल्सियस, लक्ष्य 100% नमी सोख्ता 6 सेकंड का समय है, और दाग -2 मिमी के लिए ऑफसेट.
- Gatan Solarus 950 चमक निर्वहन इकाई और खुले एच 2 और ओ 2 कनस्तरों है कि यूनिट की आपूर्ति पर पावर. प्री - साफ 50 वाट में 1 मिनट के लिए चमक निर्वहन चलाकर नमूना कक्ष.
- छेददार एक गिलास coverslip, कार्बन ऊपर की ओर, और शीर्ष लोड हो रहा है दरवाजे के माध्यम से चमक निर्वहन नमूना कक्ष के अंदर जगह पर कार्बन ग्रिड की वांछित संख्या व्यवस्थित. 6-10 सेकंड के लिए 25 वाट में चमक निर्वहन चलाकर साफ़ ग्रिड. (ध्यान दें कि Quantifoil ब्रांड इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता ग्रिड के कार्बन पक्ष दिखने में मैट हैं यह सभी वाणिज्यिक ग्रिड के लिए सच नहीं हो सकता है तो यह सबसे अच्छा है करने के लिए निर्माता से इस जानकारी को प्राप्त होगा.)
- जगह सीओओ अंदर ग्रिड बॉक्स (ते)lant कंटेनर, कटोरा, और केंद्रीय कप है कि शीतलक कटोरा के भीतर बैठता है पर थर्मल विसारक धुरी. धीरे धीरे कटोरा में जोरदार बुदबुदाती उतरे जब तक तरल एन 2, डाल कटोरा और तरल के बीच संतुलन का संकेत है. तरल एन प्रक्रिया के शेष भर में 2 स्तर, इसे केंद्रीय कप से बाहर रखने के ख्याल रख रही रखें .
- एटैन गैस कनस्तर, और एक गिलास विंदुक के लिए दूसरे छोर पर एक प्लास्टिक की नली के एक छोर संलग्न. केंद्रीय कप के नीचे के लिए ग्लास विंदुक टिप पकड़ो, एक धीमी, स्थिर एटैन प्रवाह की स्थापना, और एटैन संघनक शुरू हो जाएगा. भरने जब तक केंद्रीय कप भरा हुआ है जारी रखें. केंद्रीय कप से धुरी निकालें.
- 10 AT-2 एचआईवी -1 वायरस निलंबन निष्क्रिय μL 2 μL प्रोटीन एक सोने colloid मापकला जोड़कर नमूना मिश्रण तैयार करें. धीरे मिश्रण विंदुक के समाधान में fiducials लाने के लिए. बर्फ पर रखें.
- विशेष Vitrobot चिमटी के साथ एक ग्रिड के बाहरी रिम समझ. कार्बन एस के लिए नमूना मिश्रण के 2 μL लागूग्रिड के आईडीई. तुरंत रोबोट हिदायत humidified जलवायु चैम्बर, दाग, और डुबकी फ्रीज में तरल एटैन में नमूना लोड.
- ग्रिड बॉक्स vitrified ग्रिड स्थानांतरण. 1.7 कदम दोहराएँ. ग्रिड की वांछित संख्या में उत्पादन. जब समाप्त हो, तो जल्दी छोटे से तरल नाइट्रोजन परिवहन Dewar बॉक्स (ते) हस्तांतरण ग्रिड बॉक्स ढक्कन (ओं) पर शिकंजा कसने.
2. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लोड हो रहा नमूने
इस अनुभाग के दौरान तरल N लोडिंग कक्ष में स्तर 2 चौकस निगरानी की जानी चाहिए, और तरल मंगाया की जरूरत के रूप में, करने के लिए सुनिश्चित करें कि ग्रिड बक्से डूबे रहते हैं. एक ग्रिड के साथ संपर्क में एक उपकरण लाने से पहले, यह यह 2 एन तरल में submerging जब तक यह तरल के साथ equilibrates द्वारा शांत. प्रत्येक उपयोग के बाद, उपकरण एक गर्म हवा बंदूक का इस्तेमाल defrosted होना चाहिए.
इस अनुभाग के दौरान फी Tecnai G2 Polara संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता हैGatan क्रायो कार्य केंद्र के साथ. जबकि तरल के तहत लोड हो रहा नमूने एन 2 शर्तों के सिद्धांत सभी क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी काम करने के लिए लागू होता है, इस अनुभाग के चरणों प्रयोग में इस्तेमाल किया उपकरणों के लिए विशिष्ट हैं. विभिन्न उपकरणों के लिए इस्तेमाल किया चरणों निर्माता द्वारा अलग अलग होंगे.
चेतावनी: इस अनुभाग के दौरान हमेशा सुरक्षात्मक eyewear और कपड़े पहन जब तरल N 2 से निपटने.
- सुनिश्चित करें कि मंदिर Compustage एक नमूना कारतूस नहीं होते हैं, और नमूना चयन रॉड और सम्मिलन रॉड नीचे 110 लालकृष्ण
- कूल और नमूना भंडारण ब्लॉक, जो नमूना चयन रॉड का हिस्सा है में ग्रिड को लोड करने के लिए क्रायो वर्कस्टेशन तैयार.
- खुर्दबीन से क्रायो कार्य केंद्र के लिए ठंडा (<110 कश्मीर) चयन रॉड स्थानांतरण.
- स्लाइड चयन रॉड आगे नाइट्रोजन स्नान में क्रायो कार्य केंद्र पर चयन ब्लॉक डालने के लिए. भंडारण ब्लॉक का उपयोग विशेष ग से सभी नमूना कारतूस निकालेंसंदंश artridge से निपटने. प्लेस वर्कस्टेशन लोड हो रहा है में ग्रिड बॉक्स (ते) और एक शराबी के साथ (ओं) ढक्कन ढीला.
- चिमटी का उपयोग करें ग्रिड ग्रिड और कारतूस में बॉक्स जगह से हटाने. ग्रिड के शीर्ष पर एक सी क्लिप जमा है, कारतूस में ग्रिड हासिल विशेष नियुक्ति सी क्लिप उपकरण का प्रयोग करें.
- 2.5 कदम दोहराएँ. जब तक ग्रिड की वांछित संख्या कारतूस में हैं. नमूना चयन ब्लॉक करने के लिए कारतूस स्थानांतरण.
- नमूना चयन छड़ी के हटाने के लिए क्रायो कार्य केंद्र तैयार. चयन छड़ी वापस स्लाइड नाइट्रोजन स्नान से चयन ब्लॉक हटायें. क्रायो कार्य केंद्र से चयन छड़ी निकालें और मंदिर के लिए देते हैं.
3. क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा हासिल
इस अनुभाग के दौरान फी बैच टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस करने के लिए एक बैच फ़ाइल है कि ब्याज के सभी ग्रिड पदों के निर्देशांक भंडार स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जब उपयोगकर्ता द्वारा निर्देश, बैच टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर पदों के प्रत्येक फिर से आना होगा और समन्वय करेंगेझुकाव के माध्यम से श्रृंखला अधिग्रहण डिजिटल सूक्ष्मग्राफ. यदि इस सॉफ़्टवेयर उपलब्ध नहीं है, Leginon सॉफ्टवेयर पैकेज व्यवहार्य मुक्त, खुला स्रोत 13 वैकल्पिक है. इमेजिंग कीव 200 में किया गया था, एक पोस्ट-GIF 2K एक्स 2K सीसीडी कैमरा (Gatan) के साथ एक Gatan इमेजिंग फ़िल्टर (GIF) का उपयोग.
- स्थिति Compustage जैसे कि इलेक्ट्रॉन बीम वैक्यूम के माध्यम से गुजरता है. उच्च आवर्धन (34kX) एक्स्पोज़र मोड में स्विच करें और प्रत्यक्ष संरेखण प्रदर्शन.
- शून्य ऊर्जा फिल्टर पर हानि चोटी संरेखित करें. (यह शून्य ऊर्जा नुकसान के साथ इलेक्ट्रॉनों के लिए एक संदर्भ के साथ ऊर्जा फिल्टर प्रदान करता है.)
- एक ग्रिड कार्बन विशेषता क्षेत्र Compustage ले जाएँ. कम (4.5kX) बढ़ाई खोज मोड में, Wobbler समारोह का उपयोग करें + / -15 ° के बीच मंच के आगे और पीछे झुकाव. इस बीच जेड अक्ष चरण स्थिति को समायोजित जब तक न्यूनतम चरण पारी मनाया जाता है. (यह eucentric ऊंचाई पर चरण लगभग पदों). Wobbler अक्षम जब कोई मंच बदलाव मनाया जाता है.
- स्वचालित Eucentric ऊँचाई च का उपयोग करें गर्मजोशी eucentric ऊंचाई को परिष्कृत करने के लिए. (यह दिनचर्या पार सहसंबंध का उपयोग करता है 3.3 चरण में से एक और अधिक सटीक eucentric ऊंचाई प्राप्त है). Eucentric ऊंचाई बैच टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर द्वारा बाद में संदर्भ के लिए स्वचालित रूप से संग्रहीत किया जाता है.
- लगभग तीन से छह virions की विशेषता ब्याज की एक क्षेत्र है, और कोई कम से कम दस मापकला मार्कर का पता लगाएं. इस ग्रिड की स्थिति बैच टोमोग्राफी फ़ाइल के लिए जोड़ें.
- दोहराएँ कदम 3.4. और 3.5. जब तक पदों की वांछित संख्या नामित कर रहे हैं. बैच पैरामीटर (± में 2 ° झुकाव वेतन वृद्धि के साथ ° 60, 1-2 ई - / 2 / झुकाव दृश्य) को परिभाषित करें और बैच चलाने.
4. पुनर्निर्माण क्रायो - इलेक्ट्रॉन tomograms
- झुकाव 1 RAPTOR में स्वत: मापकला आधारित संरेखण का उपयोग कर श्रृंखला संरेखित करें .
- 8 IMOD में आर भारित वापस प्रक्षेपण का उपयोग tomograms का पुनर्निर्माण किया . परिणामी डेटा संस्करणों के लिए मानक फ़ाइल स्वरूप MRC फ़ाइल है, फ़ाइल एक्सटेंशन के साथ MRC.
यह खंड IMOD है कि उपयोगकर्ता tomogram भीतर virion subvolumes निर्दिष्ट करने की अनुमति देता है की एक स्वनिर्धारित विस्तार का उपयोग करता है. धारा 6 में, उपयोगकर्ता virion सीमाओं को परिभाषित एक सतह है जो साथ spikes स्वचालित रूप से चयन कर रहे हैं के रूप में उपयोग किया जाता है.
- IMOD खोलें और एक virions के साथ आबादी tomogram लोड.
- Tomogram की z-अक्ष के साथ नेविगेट तक virions के माध्यम से केंद्रीय टुकड़ा स्थित है. सत्यापित करें कि virion केन्द्रक की पहचान की गई है. ऐसा करने के बाद, एक virion मार्कर जमा. इस मार्कर धारा 6 में स्वचालित virion विभाजन उपयोगिता द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा.
- केन्द्रक पदनाम जारी रखें जब तक सभी virion संस्करणों की पहचान कर रहे हैं.
- Tomogram बंद करें और मार्कर सेट परिभाषित virion centroids बचाने. दोहराएँ जब तक virions सभी tomograms में नामित किया गया है.
- चार का एक पहलू द्वारा IMOD, नीचे नमूना virion subtomograms का उपयोग.
- Denoise virions बढ़त बढ़ाने anisotropic प्रसार का उपयोग के रूप में IMOD में लागू किया है.
- Unsupervised झिल्ली एक ऊर्जा आधारित तीन आयामी (Bartesaghi एट अल में विस्तृत 2005.) दृष्टिकोण 3 का उपयोग कर विभाजन के अधीन रहते हुए virions.
- Spikes खंडों virion खास स्थान और एक कृत्रिम सममित कील की तरह मात्रा के बीच पार सहसंबंध के स्थानीय मॅक्सिमा इसी सतहों पर स्थानों पर पहचाने जाते हैं. एक निर्दिष्ट सीमा से ऊपर उन स्थानों ख्यात स्पाइक subvolumes के लिए निर्देशांक की एक सूची के लिए जोड़ रहे हैं.
6. वर्गीकृत और कणों औसत
- Computationally tomogram subvolumes प्रत्येक स्थान है कि 5.8 चरण में पहचान की थी पर (100 x 100 x 100 voxels) निकालने. (इस denoising या binning बिना किया जाता है). subvolumes के परिणामस्वरूप संग्रह कील प्रोटीन है कि और निम्नलिखित चरणों में वर्गीकृत किया जाएगा औसत होते हैं.
- डीetermine स्पाइक की लंबी अक्ष प्रत्येक स्पाइक के स्थान पर स्वचालित रूप से खंडित झिल्ली को सामान्य का उपयोग कर के झुकाव. इस दृष्टिकोण के लिए दो तीन यूलर कोण का प्रारंभिक अनुमान प्रदान करता है.
- बाद संरेखण में किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को रोकने के शेष में जगह रोटेशन randomize.
- Subvolumes के लिए यूलर कोण लागू करें, तो translationally उनके cylindrically औसत वैश्विक औसत subvolumes संरेखित करने के लिए वे सभी शेयर द्रव्यमान का एक ही केन्द्र सुनिश्चित.
- Subvolumes कि अद्यतन वैश्विक औसत के साथ सबसे खराब सहसंबंधी के 10% निकालें. यह जा रहा है ग़लती के spikes की पहचान का सबसे बड़ा जोखिम में घनत्व निकालने के लिए किया जाता है.
- संरेखित करें और बाह्य संदर्भों का उपयोग कर के बिना और लापता पच्चर के समुचित लेखा (Bartesaghi एट अल 2008. विस्तृत) 4 के साथ कील संस्करणों वर्गीकृत . उत्तरोत्तर subvolume संरेखण को निखारने और प्रत्येक चलना में कील संस्करणों वर्गीकृत.
- तीन गुना समरूपता स्पष्ट रूप से वर्गीकरण के प्रारंभिक चरणों में मनाया जाना चाहिए, और चौथे चलना, 3 गुना समरूपता लगाया है. हर दौर में, सबसे अच्छी तरह से परिभाषित वर्गों औसत रहे हैं और अगले दौर के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया.
- आमतौर पर ~ 4000 spikes के प्रत्येक डाटासेट के लिए चयनित किया जाना चाहिए है. अंतिम घनत्व नक्शे ~ 5-12 शोधन राउंड के बाद प्राप्त कर रहे हैं और ~ प्रत्येक डाटासेट में उप - खंडों की 50% से योगदान शामिल होंगे.
7. फिटिंग समन्वय
- घनत्व नक्शे कदम 6.8 से परिणामस्वरूप UCSF कल्पना 12 में खोल रहे हैं.
- उत्पाद एक नकली एक्स - रे के 20 एक नक्शे कल्पना या एमन 10 का उपयोग कर निर्देशांक.
- डॉक यादृच्छिक झुकाव में निर्देशांक. कल्पना steepest - चढ़ाई के स्थानीय अनुकूलन में बनाया है का उपयोग, प्रदर्शन 100 steepest चढ़ाई कदम के गुणकों तक अभिसरण प्राप्त की है निर्देशांक फिट.
8. प्रतिनिधि परिणाम
3D औसतन और समन्वय फिटिंग, एचआईवी और SIV के लि स्पाइक संरचनाओं की एक किस्म का उपयोग हल कर दिया गया है. चित्र में प्रस्तुत 3A एचआईवी -1 तनाव, बाल (बैंगनी) से लिफाफा स्पाइक की संरचना है. कील ~ Å 120 के आयाम के रूप में कील शीर्ष करने के लिए झिल्ली से मापा के साथ समरूपता तीन गुना है, और जो ~~ 35 Å नीचे स्पाइक के आधार पर tapers ~ 150 ए की एक अधिकतम चौड़ाई है. चित्रा 3B में देखा trimeric पर्यावरण के लिए घनत्व नक्शा monomeric gp120 के लिए crystallographically निर्धारित संरचना (लाल, PDB आईडी, 2NY7 से व्युत्पन्न) के साथ क्रायो - इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का उपयोग करने के लिए निर्धारित संयोजन के द्वारा, हम एक काम करने के लिए आणविक मॉडल प्राप्त करने में सक्षम थे trimeric लिफाफा glycoprotein (PDB आईडी, 3DNN) जटिल 9.
हमारा दृष्टिकोण भी trimeric पर्यावरण और gp120 विशिष्ट प्रोटीन की एक किस्म के बीच गठित परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैटुकड़े और एंटीबॉडी. इस का एक उदाहरण है, जिसमें पर्यावरण मोटे तौर पर उदासीन B12 फैब के साथ complexed है चित्रा 4A (पूरे परिसर में बैंगनी में दिखाया गया है) में दिखाया गया है. यह आंकड़ा, बी 12 के लिए अतिरिक्त इसी घनत्व जावक स्पाइक से पेश हुए देखा है, और समानांतर झिल्ली को. ऐसे परिसरों की स्ट्रक्चरल व्याख्याएं स्पाइक के भाग के लिए परमाणु निर्देशांक, इसी ligand करने के लिए बाध्य के साथ घनत्व नक्शे फिटिंग द्वारा आणविक स्तर तक बढ़ाया जा सकता है. चित्रा 4B, जब इस घनत्व नक्शा gp120 कील प्रोटीन के निर्देशांक (लाल, PDB आईडी, 2NY7 से व्युत्पन्न) बी 12 फैब (सफेद), तीन gp120 कोर के रिश्तेदार झुकाव से बंधे के साथ फिट है में देखा discerned किया जा कर सकते हैं (PDB 3DNL, आईडी). इन गठनात्मक रिश्तों को समझ कैसे ऐसी ligands स्पाइक के साथ बातचीत और वायरस गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करने के लिए शिक्षाप्रद हैं. Unliganded और liganded पर्यावरण के कुछ अन्य संरचनाओं कि विधि द्वारा हल किया गया है यहाँ प्रस्तुत inclUde के उन एचआईवी-1 R3A, SIV CP मैक, SIVmneE11S और SIVmac239 एचआईवी-1 बाल लि, sCD4 और 17B फैब के बीच त्रिगुट जटिल, और SIV सी.पी. मैक लि 7D3 9,14 एंटीबॉडी complexed .
चित्रा 1 वायरल निलंबन से 3D संरचना: क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण में वैचारिक कदम.
चित्रा 2 (ए) एचआईवी -1 virions की एक tomogram से एक प्रतिनिधि टुकड़ा. (बी) के कोर और सतह के spikes के साथ एक एकल virion एचआईवी -1, रेखाचित्र के रूप में दिखाया.
चित्रा 3 (ए) एचआईवी -1 बाल लिफाफा glycoprotein (सतह के spikes) के रूप में वायरल झिल्ली की सतह पर प्रदर्शित की तीन आयामी संरचना. (बी) trime के लिए आण्विक मॉडलरिक spikes के gp120 monomeric (लाल) 9 नक्शा घनत्व में एक्स - रे क्रि द्वारा प्राप्त के लिए संरचनाओं की तीन प्रतियां रखकर निर्धारित की .
चित्रा 4 (ए) एक मोटे तौर पर उदासीन एंटीबॉडी के फैब टुकड़ा, बी 12 के साथ परिसर में एचआईवी-1 बाल लिफाफा glycoprotein के तीन आयामी संरचना . (बी) परिसर के लिए आण्विक मॉडल monomeric gp120 - बी 12 फैब 9 नक्शा घनत्व में एक्स - रे क्रि द्वारा व्युत्पन्न परिसर के लिए संरचनाओं की तीन प्रतियां रखकर निर्धारित किया है.
Discussion
क्रायो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और तीन आयामी वर्गीकरण और औसत तरीकों यहाँ ~ 20 एक संकल्प लिफाफा glycoprotein परिसरों के तीन आयामी संरचना के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं प्रस्तुत किया. एक्स - रे की फिटिंग घनत्व नक्शे monomeric घटकों के निर्देशांक आण्विक स्तर पर संरचनात्मक व्याख्या के लिए अनुमति देता है. कम लागत खुला स्रोत वैज्ञानिक उपकरणों और नेटवर्क के बुनियादी ढांचे के प्रसार में विकास के साथ संयुक्त कंप्यूटिंग उपकरणों में सतत सुधार संभव पहले से अकल्पनीय वैज्ञानिक सहयोगात्मक प्रयासों बनाते हैं. हम इन घटनाओं का लाभ ले लो और पता चलता है कि उन्नत वैज्ञानिक तकनीक कई उम्र के छात्रों की पहुंच के भीतर लाया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम एड्स और कैंसर वायरस प्रोग्राम, SAIC फ्रेडरिक, इंक के जैविक उत्पाद खंड धन्यवाद, शुद्ध उपलब्ध कराने के लिए Biowulf के उच्च प्रदर्शन कम्प्यूटेशनल क्षमताओं के उपयोग के साथ सहायता के लिए एचआईवी -1 वायरस, स्टीवन फेलिनी और उनके सहयोगियों ने इलाज-2 एटी, एनआईएच, Bethesda, एमडी में लिनक्स क्लस्टर (http://biowulf.nih.gov) , इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए फी कंपनी, और एतान टायलर आंकड़ों के साथ विशेषज्ञ की सहायता के लिए. यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, Bethesda, एमडी में कैंसर अनुसंधान के लिए केंद्र से धन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
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