Summary
프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.
Abstract
거의 30 년전의 발견 이후, 이상 6천만명는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염되었습니다 (www.usaid.gov) . 바이러스는 감염과 CD4 + T - 세포함으로써 면역 체계 타격, 그리고 면역 결핍 증후군 인수 (AIDS) 2 일으키는 파괴. HIV의 봉투 당단백질는 "스파이크"가 CD4 + T 세포의 표면에있는 CD4 수용체와 접촉을하게되면 감염이 시작됩니다. 이 상호 작용은 두 번째 세포 표면 공동 수용체 5,9와 상호 작용을 촉진 스파이크에 conformational 변화를 유도. HIV 감염 경로에 이러한 단백질 상호 작용의 의미는 근본적인 HIV 연구에 깊은 중요성을하게하고, HIV 백신의 추구 인치
더 나은 HIV 세포 연락처 및 중화의 분자 규모의 상호 작용을 이해할 필요가를 결정하는 기술의 개발 동기세포 표면 수용체 단백질 및 분자 블록 감염과 상호 작용 HIV 스파이크의 구조. cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여, 우리는 최근 ~ 20 해상도 9,14에서 기본 바이러스의 표면에 같은 구조를 결정하는 능력을 보여주었다. 이 접근은 해결 HIV 봉투 구조에 국한되지, 기타 바이러스성 막 단백질과 단백질 리포좀에 재구성하기 위해 확장될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 정화 HIV의 virions부터 시작하고, vitrified 샘플을 준비 cryo - 전자 현미경 데이터를 수집, reconstituting 및 3D 데이터 볼륨을 처리 평균 및 3D 단백질 subvolumes 분류를 통해 stepwise 진행 HIV 봉투 glycoproteins의 구조를 얻는 방법에 대해 설명하고, 단백질 모델을 생산하는 결과를 해석합니다. 우리의 접근 방식의 전산 측면 액세스하고 Biowulf GNU / 리눅스 병렬 P를 사용하여 원격으로 실행할 수 있습니다 모듈에 적응했다NIH에서 rocessing 클러스터 (http://biowulf.nih.gov) . 저가의 컴퓨터 하드웨어와 고속 네트워크 액세스와 함께이 원격 액세스, 학교 또는 가정에서 일하는 연구자와 학생들의 참여를 가능하게하고 있습니다.
Protocol
여기에서 설명한 방법은 악기, 도구 및 소프트웨어의 특정 집합을 사용하여 개발되었습니다. 모든 실험실이 같은 실험 설정을 사용하지 않는 때문에, 노력을 어디에 가능한 접근 방법을 일반화하고, 이것이 불가능했던 대안을 제공하기 위해 만들어졌다.
1. vitrified 바이러스 샘플을 준비
다음 섹션에서 vitrified 격자는 황비홍 Vitrobot 마크 III, blotting 및 다이빙 냉동 로봇을 사용하여 준비하고 있습니다. 이 시스템 7을 사용하는 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대한 랑쿠는, 외 있습니다. 참조하십시오. 로봇 플런저의 대안으로, 단두대 - 스타일이나 중력 플런저은 6 완벽하게 충분합니다.
제 1.2. 및 1.3. 전자 현미경의 격자 사용하기 위해 설계된 모든 글로우 방전 장치가 대체 수 있지만 Gatan Solarus 950 글로우 방전 장치는 샘플 격자를 청소하고 친수성을 향상하는 데 사용됩니다.
blotting 및 플런지 냉동 전에 그리드에 적용 샘플 볼륨의 양을 2 μL의 범위에 있어야 내용 "> 있지만, 샘플 혼합물에있는 바이러스 및 단백질 - 금 콜로이드의 볼륨 소스에 따라 다릅니다. 따라서, 그것은 바이러스와 황금 dilutions 또는 비율의 범위가 테스트하고 현미경으로 몇 군데해야 될 것입니다, 그리고 이상적인 혼합은 경험적으로 결정됩니다. 참고 이미지 데이터 10 20 사이, 제 3 인수 때 황금 fiducial 마커가해야 적절한 기울기 시리즈 정렬 선물합니다.주의 :이 섹션은 가연성 아르 가스 에탄, 수소, 그리고 산소의 사용을 설명합니다. 이러한 가스를 사용할 때 적절한주의가 이동한다. 또한, biosafety의 추천에 따라 바이러스 샘플을 처리하는 신경 주의해야한다. 액체 질소 (N 2) 에탄을 다룰 때 마지막으로, 항상 보호 eyewear와 의복을 착용하십시오.
- 페이 Vitrobot 마크 준비그 N 2 가스 공급 켜기 가습기 카트리지를 설치하고 여과 탈이온수와 카트리지를 작성 III. Vitrobot에 전원 및 22의 기후 챔버 온도를 설정 -2 mm까지 오프셋 ° C, 100 % 대상 습도, 6 초에 blotting 시간 및 얼룩.
- Gatan Solarus 950 글로우 방전 유닛과 유닛을 공급 열고 H 2 O 2 용기에 전원. 50 와츠에서 1 분 글로우 방전을 실행하여 미리 깨끗한 표본 챔버.
- 유리 coverslip 최대 탄소 측면 및 상단 로딩 문을 통해 글로우 방전 표본 챔버 내부의 장소에 구멍 투성이의 탄소 격자의 원하는 숫자를 정렬. 25 와츠에서 60-10 초에 대한 글로우 방전을 실행하여 청소 격자. (이 프로토콜에서 사용되는 Quantifoil 브랜드 격자의 탄소 측면이 외관에 무광택있다. 제조 업체에서이 정보를 얻기 위해 최선되도록 이것은 모든 상업적인 격자에 대한 진실되지 않습니다 있습니다.)
- 쿠 내부 장소 그리드 상자 (ES)lant 컨테이너 그릇, 그리고 냉각수 그릇 안에 앉아 중앙 컵에서 열 확산 스핀들. 천천히 그릇과 액체 사이의 평형을 나타내는, 활발한 기포의 가라 앉다까지 그릇에 액체 N 2를 부어. 액체 N 절차의 나머지 부분에 걸쳐 2 수준, 그것을 중앙 컵 밖으로주의한다를 유지합니다.
- 에탄 가스 용기 및 유리 피펫에 다른 끝에 플라스틱 호스의 한쪽 끝을 연결합니다. 중앙 컵 바닥에 유리 피펫 팁을 잡고, 천천히, 꾸준한 에탄 흐름을 수립하고, 에탄은 응축 시작됩니다. 중앙 컵 전체 때까지 충전을 계속합니다. 중앙 컵에서 스핀들을 제거합니다.
- HIV - 1 바이러스 정지 AT - 2 inactivated 10 μL 2 μL 단백질 금 콜로이드 fiducial를 추가하여 샘플 혼합물을 준비합니다. 부드럽게 솔루션으로 fiducials을 제공할 혼합물을 피펫. 얼음 계속.
- 전문 Vitrobot 핀셋과 격자의 바깥쪽 가장자리를 파악. 탄소의 샘플 혼합 2 μL를 적용그리드의 IDE. 즉시 액체 에탄의 humidified 기후 챔버, 얼룩 및 다이빙의 동결로 샘플을로드하는 로봇을 지시합니다.
- 격자 상자 vitrified 격자를 전송합니다. 1.7 단계를 반복합니다. 격자의 원하는 번호를 생성합니다. 완료되면, 격자 상자 뚜껑 (S)에 나사 후 신속하게 작은 액체 질소 수송 dewar에 (ES) 상자를 전송 조입니다.
2. 로딩 샘플 전송 전자 현미경으로
이 섹션 동안 로딩 챔버에있는 액체가 N 2 수준은 vigilantly 모니터링하고, 필요에 따라 액체 보충함, 격자 상자 포장되어 유지하도록해야합니다. 그리드와 접촉 도구를 데리고 전에, 그것은 액체와 equilibrates 때까지 액체 N 2에 그것을 잠수함이 잠수하여 냉각. 각 사용 후, 도구는 뜨거운 공기 총을 사용하는 사인을 알아낼 수 없을해야합니다.
이 섹션에 걸쳐 페이 Tecnai G2 Polara 전송 전자 현미경 (TEM)이 함께 사용됩니다Gatan Cryo 워크 스테이션과 함께. 로딩 액체 아래에 샘플을 N이 조건의 원칙이 모든 cryo - 전자 현미경 작업에 적용하는 동안,이 섹션의 단계는 실험에 사용된 장비에 따라 다릅니다. 다른 장비에 사용되는 단계는 제조 업체에 따라 다를 수 있습니다.
주의 : 액체 N 2 다룰 때이 섹션 전반에 걸쳐 항상 보호 eyewear와 의복을 착용하십시오.
- 그 TEM의 Compustage는 표본 카트리지를 포함하며, 표본 선정로드 및 삽입 막대 아래 110 K. 있는지 확인하지 않습니다
- 시원하고 샘플 선택 막대의 일부인 표본 스토리지 블록으로 격자를로드하는 Cryo 워크 스테이션을 준비합니다.
- Cryo 워크 스테이션에 현미경에서 냉각 (<110 K) 선택 막대를 전송합니다.
- 슬라이드 선택 막대 앞으로 Cryo 워크 스테이션에서 질소 욕조에 선택 블록을 삽입합니다. 전문 C를 사용하여 스토리지 블록에서 모든 표본 카트리지를 제거합니다집게를 artridge 처리. 장소 그리드 워크 스테이션을 로딩 상자 (ES)와 드라이버로 뚜껑 (들)을 푸세요.
- 카트리지의 격자 상자와 장소에서 그리드를 제거하는 핀셋를 사용합니다. 카트리지에 그리드를 확보, 그리드 위에 C - 클립을 입금하는 전문 C - 클립 배치 도구를 사용하십시오.
- 2.5 단계를 반복합니다. 격자의 원하는 숫자는 카트리지에까지. 표본 선택 블록에 카트리지를 전송합니다.
- 표본 선택 막대의 제거를위한 Cryo 워크 스테이션을 준비합니다. 질소 욕조에서 선택 블록을 제거하는 다시 선택 막대를 슬라이드. Cryo 워크 스테이션에서 선택 막대를 제거하고 TEM으로 첨부합니다.
3. cryo - 전자 현미경 데이터를 취득
이 섹션 동안 황비홍 일괄 Tomography 소프트웨어 인터페이스는 관심의 모든 그리드 위치의 좌표를 저장하는 배치 파일을 설정하는 데 사용됩니다. 사용자가 지시하면, 일괄 Tomography 소프트웨어는 각각의 위치를 다시 방문하고 조정합니다디지털 현미경을 통해 일련의 인수 기울기. 이 소프트웨어를 사용할 수없는 경우, Leginon 소프트웨어 패키지는 가능한 무료 오픈 소스 대안 13입니다. 이미지는 이후 GIF 2K X 2K CCD 카메라 (Gatan)와 Gatan 이미징 필터 (GIF)를 사용하여, 200 케빈에서 이루어졌다.
- 위치 Compustage 같은 것을 전자빔 진공을 통해 전달합니다. 높은 배율 (34kX) 노출 모드로 전환하여 직접 정렬을 수행합니다.
- 에너지 필터 제로 손실 피크를 맞춥니다. (이것은 제로 에너지 손실과 함께 전자에 대한 참조와 함께 에너지 필터를 제공합니다.)
- 탄소를 갖춘 그리드 영역으로 Compustage 이동합니다. 낮은 배율 (4.5kX) 검색 모드에서 + / -15 ° 사이에서 앞뒤로 무대를 기울 비틀비틀 기능을 사용하십시오. 최소한의 무대 변화가 관찰되기 전까지 한편 Z 축 스테이지의 위치를 조정합니다. (이것은 eucentric 높이 약 무대를 위치). 어떤 무대 변화가 관찰 없을 때 비틀비틀을 해제합니다.
- 자동 Eucentric 높이 F를 사용하여 기름 부음은 eucentric 높이를 수정할 수 있습니다. (이 루틴 3.3 단계에서보다 더 정확한 eucentric 높이를 얻기 위해 상호 상관을 사용). Eucentric 높이는 배치 Tomography 소프트웨어가 나중에 참조할 수 있도록 자동으로 저장됩니다.
- 약 3-6 virions을 갖춘 관심의 영역없이 10 % 이상 fiducial 마커를 찾습니다. 배치 tomography 파일이 그리드 위치를 추가합니다.
- 반복 3.4 단계를 반복합니다. 및 3.5. 위치의 원하는 번호가 지정되기 전까지는. 배치 매개 변수를 (2 · 틸트 단위로 ± 60 °, 1-2 E - / 2 / 틸트보기) 정의 및 배치를 실행합니다.
4. 재구성 cryo - 전자 tomograms
- 랩터 1 자동 fiducial 기반 정렬을 사용하여 기울기 시리즈를 맞춥니다.
- IMOD 8 R - 가중 다시 프로젝션을 사용하여 tomograms를 재구성. 결과 데이터 볼륨에 대한 표준 파일 포맷은 파일 확장명을 가진, MRC 파일입니다. MRC가.
이 섹션은 사용자가 tomogram 이내 virion의 subvolumes을 지정할 수 있습니다 IMOD의 사용자 정의 확장자를 사용합니다. 제 6에서 virion의 경계를 정의 사용자는 스파이크가 자동으로 선택되는 함께 표면으로 사용됩니다.
- IMOD를 열고 virions로 채워집 tomogram를로드합니다.
- virions 중 하나를 통해 중앙 슬라이스가있는 때까지 tomogram의 Z - 축을 따라 이동합니다. virion의 중심가 확인되었는지 확인합니다. 이렇게되면, virion 마커를 입금. 이 마커는 제 6의 자동 virion 세분화 유틸리티에 의해 사용됩니다.
- 모든 virion 볼륨이 확인되기 전까지 중심 지정을 계속합니다.
- tomogram를 닫고 virion의 centroids을 정의 마커 집합을 저장합니다. virions 모든 tomograms에 지정되어 때까지 반복합니다.
- 4 인 요소로 IMOD, 다운 샘플 virion의 subtomograms를 사용하여.
- 에지 향상 비등 방성 확산을 사용 Denoise의 virions는 IMOD에서 구현.
- 에너지 기반의 입체적인 접근 (Bartesaghi 외에 대한 자세한. 2005 년) 3를 사용하여 혼자 가잖아 막 세분화에 따라 virions.
- 스파이크는 특정 위치와 합성 대칭 스파이크와 같은 볼륨 사이의 교차 상관 관계의 로컬 맥시멈에 해당하는 세그먼트 virion의 표면에 위치에서 식별됩니다. 지정된 임계값 이상의 그 위치는 putative 스파이크 subvolumes에 대한 좌표 목록에 추가됩니다.
6. 입자를 분류하고 평균
- 계산 단계 5.8에서 확인된 각 위치에있는 tomogram의 subvolumes에게 (100 X 100 X 100 voxels)를 압축을 풉니다. (이것이 denoising 또는 binning없이 이루어집니다.) subvolumes의 결과 컬렉션 분류 다음과 같은 단계에 평균 될 스파이크 단백질이 포함되어 있습니다.
- 디각 스파이크의 위치에 자동으로 분할 멤브레인로 정상을 사용하여 스파이크의 긴 축 etermine의 방향. 이러한 접근 방식은 세 개의 오일러 각도의 두 초기 견적을 제공합니다.
- 후속 정렬에서 가능한 편견을 방지하기 위해 나머지 위치에서 회전을 무작위.
- subvolumes에 오일러 각도를 적용한 후 translationally 그들은 모두가 공유에게 대량의 동일한 중심을 보장하기 위해 cylindrically 평균 글로벌 평균 subvolumes을 맞춥니다.
- 업데이트된 글로벌 평균이 가장 저조한 상관 관계 subvolumes의 10 %를 제거합니다. 이것은 잘못 스파이크를 식별되는 가장 큰 위험에 밀도를 제거하기위한 것입니다.
- 정렬 및 외부 참조를 사용하지 않고 있으며 실종 쐐기의 적절한 회계 (Bartesaghi 외. 2008 년 세부) 4 스파이크 볼륨을 분류. 점차적으로 subvolume의 정렬을 수정하고 각 반복에서 증가 볼륨을 분류.
- 3 배 대칭은 명확하게 분류의 초기 단계에서 관찰되어야하고, 네 번째 반복에서 3 배 대칭이 부과됩니다. 각 라운드에서 가장 잘 정의된 클래스가 평균이며, 다음 라운드에 대한 참조로 사용.
- 일반적으로 4,000 ~ 스파이크는 각 세트에 대해 선택해야합니다. 최종 밀도지도 ~ 5-12 상세 검색 라운드를 얻을 수있다 각 세트에서 서브 권 ~ 50 %에서 기부금이 포함됩니다.
7. 피팅 조정
- 단계 6.8으로 인한 밀도지도 UCSF 키메라 12 열립니다.
- X - 레이의 시뮬레이션 20지도를 만들은 키메라 또는 EMAN 10를 사용하여 조정합니다.
- 도킹은 임의의 방향으로 조정합니다. 키메라가 가파른 상승 - 현지 최적화에 내장된의 사용, 컨버전스를 얻을 때까지 100 가파른 상승 단계의 배수를 수행하여 좌표를 맞습니다.
8. 대표 결과
3D 평균과 협력 피팅, HIV와 SIV 환경을 스파이크 구조의 다양한 사용하는 것은 해결되었습니다. 그림에 표시된 3A는 HIV - 1 변형, BAL (보라색)에서 봉투 스파이크의 구조입니다. 스파이크는 세 배 이상으로 증가 꼭대기 멤브레인에서 측정된 ~ 120의 크기와 대칭, 그리고 스파이크의 기지에서 ~ 35까지 tapers ~ 150의 최대한의 너비 있습니다. 마찬가지로 monomeric gp120에 대한 crystallographically 결정 구조 (빨강, PDB ID, 2NY7에서 파생된)와 cryo - 전자 tomography를 사용하여 결정 trimeric 환경을위한 밀도지도를 결합하여, 그림 3B에서 본, 우리는을 위해 작동하는 분자 모델을 얻을 수 있었다 trimeric 봉투 당단백질 복합 (PDB ID, 3DNN) 9.
우리의 접근 방식은 또한 환경을 trimeric 및 gp120 특정 단백질의 다양한 사이에 형성된 단지의 구조 분석을 위해 수조각 및 항체. 환경을이 크게 중화 b12 팹과 complexed되는이 예제는 그림 4A (전체 건물은 자주색으로 표시됩니다)에 표시됩니다. 이 그림에서, b12에 해당하는 여분의 밀도는 스파이크에서 바깥쪽으로 돌출 본, 및 병렬 멤브레인하는 것입니다. 같은 단지의 구조 해석은 해당 리간드에 바인딩 스파이크의 일부에 대한 원자 좌표와 밀도지도를 피팅하여 분자 수준으로 확장될 수 있습니다. 본 밀도지도가 b12 팹 (흰색), 3 gp120 코어의 상대적인 방향에 의해 구속 gp120 스파이크 단백질의 좌표 (PDB ID, 2NY7에서 파생된 빨간색)가 장착되어있다 그림 4B에서 본 것은 (PDB 분별 수 있습니다 ID, 3DNL). 이러한 conformational 관계는 리간드가 스파이크와 상호 작용 및 바이러스의 활동을 방해하는 방법 이해 될지는 수 있습니다. 방법으로 해결되었습니다 unliganded 및 liganded 환경을 일부 다른 구조는 여기에 포함을 제시ude의 그 HIV - 1 R3A, SIV CP - MAC, SIVmneE11S 및 SIVmac239, HIV - 1 발 환경을, sCD4와 17b 팹 사이의 3 원 복잡하고, SIV CP - 맥 환경을이 7D3 항체 9,14로 complexed.
그림 1은 바이러스 정지 3D 구조 :. cryo - 전자 현미경 및 3D 재건 개념 단계를 반복합니다.
그림 2. HIV - 1 virions의 tomogram에서 (A) 대표 슬라이스. (B) 코어 및 표면 스파이크와 함께 하나의 HIV - 1의 virion은 간략하게 구조 표시됩니다.
그림 3.로 바이러스 막의 표면에 표시된 HIV - 1 BAL 봉투 당단백질 (표면 스파이크)의 (A) 3 차원 구조. trime 위해 (B) 분자 모델RIC 스파이크는 밀도지도 9에 X - 선 crystallography에 의해 파생된 monomeric gp120 (적색)에 대한 구조의 세 복사본을 배치하여 결정됩니다.
그림 4. 광범위 중화 항체의 팹 조각, b12 복잡한에서 HIV - 1 BAL 봉투 당단백질의 (A) 3 차원 구조. (B)에 대한 복잡한 분자 모델은 밀도지도 9에 X - 선 crystallography에 의해 파생된 monomeric gp120 - B12 팹 복합 구조에 대한 세 복사본을 배치하여 결정됩니다.
Discussion
cryo - 전자 현미경 입체 분류 및 평균 방법은 여기 ~ 20 해상도 봉투 당단백질의 단지 세 가지 차원 구조의 결정에 대한 허용을 제시. X - 레이의 피팅은 밀도지도에 monomeric 구성 요소의 좌표 분자 수준에서 구조 해석을 허용합니다. 오픈 소스 과학적 도구와 네트워크 인프라의 확산에 발전과 함께 저비용 컴퓨팅 장비에 계속 개선이 가능 이전에 상상할 과학 공동 노력을합니다. 우리는 이러한 발전을 활용하고 첨단 과학 기술이 다양한 연령의 학생의 도달 범위 내에 반입할 수 수 보여줍니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 HIV - 1 바이러스, 스티븐 펠리니와 동료를 치료 - 2 Biowulf의 고성능 전산 기능을 사용 지원, 정화 제공을 위해, 에이즈 및 암 바이러스 프로그램, SAIC 프레더릭, Inc의의 생물학 제품과 감사 NIH, 베데스다, MD에서 리눅스 클러스터 (http://biowulf.nih.gov) 그림과 전문가 지원, 전자 현미경과 함께 지원 황비홍 회사, 그리고 이단 타일러. 이 작품은 국립 암 연구소, 국립 보건 연구소, 베데스다, MD에서 암 연구 센터에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
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