Summary
Cet article décrit une
Abstract
La dissémination métastatique des cellules malignes nécessite une dégradation de la membrane basale, la fixation des cellules tumorales à l'endothélium vasculaire, la rétraction des jonctions endothéliales et, enfin, l'invasion et la migration des cellules tumorales dans la couche endothéliale à pénétrer dans le sang en tant que moyen de transport à des sites distants chez l'hôte 1-3. Une fois dans le système circulatoire, les cellules cancéreuses adhèrent aux parois capillaires et s'extravaser aux tissus environnants pour former des tumeurs métastatiques 4,5. Les différentes composantes de l'interaction cellulaire des cellules endothéliales tumorales peuvent être reproduits in vitro en contestant une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) avec des cellules cancéreuses. Les études réalisées avec la microscopie électronique et à contraste de phase suggèrent que la séquence dans in vitro des événements représentent fidèlement le processus métastatique in vivo 6. Ici, nous décrivons une technique basée électrique impédance qui surveille et quantifie en temps réel les invasionique des cellules endothéliales par les cellules tumorales malignes.
Giaever et Keese décrit d'abord une technique de mesure des variations de l'impédance quand une population de cellules se développent à la surface des électrodes 7,8. L'instrument de xCELLigence, fabriqué par Roche, utilise une technique similaire pour mesurer les changements d'impédance électrique que les cellules se fixent et se répandent dans une boîte de culture recouvert d'une matrice de microélectrodes d'or qui couvre environ 80% de la surface au fond d'un puits. Comme les cellules se fixent et se propagent à la surface de l'électrode, elle conduit à une augmentation de l'impédance électrique 9-12. L'impédance est affiché en tant que paramètre appelé cellule d'indice sans dimension, qui est directement proportionnelle à la surface totale de culture de tissu et qui est recouverte par les cellules. Ainsi, la cellule-index peut être utilisé pour contrôler l'adhérence des cellules, d'étalement, de la morphologie et de la densité des cellules.
Le dosage de l'invasion décrit dans cet article est basé sur des changementsl'impédance électrique au niveau de l'électrode / cellule en interphase, en tant que population de cellules malignes envahir par une monocouche HUVEC (Figure 1). La perturbation des jonctions endothéliales, la rétraction de monocouche endothéliale et le remplacement par des cellules tumorales conduit à de grandes variations d'impédance. Ces modifications sont en corrélation directe avec la capacité invasive des cellules tumorales, à savoir, d'une invasion par des cellules très agressifs conduisent à de grandes variations de l'impédance de la cellule et vice versa. Cette technique permet un double avantage par rapport aux méthodes existantes de mesure invasion, tels que chambre de Boyden et analyses matrigel: 1) l'interaction cellulaire des cellules tumorales endothéliales imite de plus près le procédé in vivo, et 2) les données sont obtenues en temps réel, temps et est plus facilement quantifiable, par opposition à l'analyse des paramètres pour d'autres méthodes.
Protocol
1. Préparation
- Toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte de culture de tissus.
- La station de xCELLigence est placé dans un incubateur à 37 ° C en présence de 5% de CO 2.
- Utilisation des cellules HUVEC de passage faible, de préférence pas plus de passage 6. Aussi, assurez-vous que les cellules ne sont plus que 75% de confluence au moment de la récolte.
- Les cellules HUVEC sont cultivées dans des EGM-2 milieux reconstitués avec kit EGM-2 balles (Lonza Biosciences) contenant des facteurs de croissance, des suppléments et 5% de sérum de veau fœtal.
- Toutes les traces de trypsine doivent être retirés de suspensions cellulaires par les cellules filature à 200xg, lave une fois avec PBS, et leur remise en suspension à des densités cellulaires indiquées.
- Manteau xCELLigence E-plaque 16 avec 0,1% de gélatine pendant 1 heure à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C. Laver la plaque avec du PBS et ajouter 100 ul EGM-2 reconstituée médias. Effectuer une lecture à blanc sur le système de xCELLigence pour mesurer fondimpédance en l'absence de cellules.
2. Génération HUVEC monocouche
- Récolter un flacon sous-confluentes de cellules HUVEC par la trypsine. Remettre les cellules en reconstituées EGM-2 médias à une densité finale de 2,5 x 10 5 cellules / ml.
- Pour chaque puits d'un fond calibré E-plaque contenant 100 ul EGM-2 médias, ajouter 100 pi de la suspension de cellules HUVEC (2,5 x 10 4 cellules HUVEC).
- Installer immédiatement E-Plate dans l'instrument de xCELLigence.
- logiciel de xCELLigence de programme pour effectuer des lectures d'impédance à 10 minutes d'intervalle.
- Laissez les cellules endothéliales se développent pour 18-21 heures jusqu'à ce qu'ils forment une monocouche, comme en témoigne l'aplatissement de l'indice de la cellule (figure 2).
3. Addition des cellules et la normalisation des données d'invasion.
- Une fois une monocouche HUVEC stable s'est formée, récolte les cellules tumorales par la trypsine et remettre en suspension à une finale tanièreslité de 1 x 10 5 cellules / ml dans les médias utilisés pour cultiver des cellules tumorales (comme RPMI ou médias DMEM contenant 10% de FBS)
- lectures d'impédance de pause sur le logiciel de xCELLigence et supprimer E-Plate de la gare.
- Retirer EGM-2 médias par aspiration. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules tumorales contenant 1 x 10 4 cellules. En règle générale, un ratio 1:2,5 des cellules tumorales: cellules endothéliales ensemencées, qui fonctionne le mieux pour le dosage. Toutefois, le ratio peut être optimisé pour des lignées de cellules individuelles.
- Placer le E-plaque sur le système de xCELLigence dans l'incubateur et continuer lectures d'impédance à intervalles de 10 minutes.
- Invasion peut être suivie en temps réel au cours des prochaines 6-12 heures par une chute de l'indice de la cellule en raison de la rétraction des jonctions endothéliales et la pénétration de l'invasion des cellules tumorales.
- Normaliser les résultats au moment de l'addition d'envahir les cellules tumorales. Le logiciel permet xCELLigence normalisation à n'importe quel point du temps et des résultatspeut être directement visualisé dans la fenêtre de logiciel.
4. Les résultats représentatifs:
Un exemple de HUVEC monocouche invasion par les cellules métastatiques et non métastatiques est illustré à la figure 3. K7M2 est une lignée de cellules d'ostéosarcome métastatique. Ces cellules expriment des niveaux élevés de l'Ezrin de protéines de liaison du cytosquelette, ce qui explique les propriétés invasives de cette lignée cellulaire 13,14. Lorsque les cellules HUVEC sont mis au défi avec des cellules K7M2, il ya une baisse de la résistance électrique dans les 6 heures. Cette baisse de résistance électrique représente l'invasion de la monocouche HUVEC par les cellules tumorales envahissantes. La lignée cellulaire K12, d'autre part, exprime des niveaux beaucoup plus faibles de Ezrin et est par conséquent moins métastatique 13. Contestation de la monocouche HUVEC avec K12 cellules entraîne une baisse moins forte de la résistance que les cellules sont incapables d'adhérer ou envahir par la monocouche HUVEC (Figure 3).
Figure 2. Formation de la monocouche HUVEC. Les variations de l'indice de la cellule que les cellules HUVEC s'attacher et se propagent sur des électrodes d'or recouvertes de gélatine. La formation d'une monocouche confluente est représentée par une stabilisation de l'indice de cellules après 18 heures.
Figure 3. Invasion des cellules HUVEC par K7M2 et K12 cellules d'ostéosarcome. Une forte diminution de cell-indice survient en quelques heures de la mise en place de cellules hautement métastatiques K7M2. Cellules K12, en revanche, sont moins métastatique et sont incapables de pénétrer la monocouche endothéliale aussi efficacement que les cellules K7M2. Ceci est représenté par une moins forte baisse de l'indice de la cellule lorsque la monocouche HUVEC est contestée par des cellules K12. Contrôle représente l'impédance de monocouche HUVEC en l'absence de cellules cancéreuses. Des expériences ont été réalisées en triple.
Discussion
Le dosage de l'invasion HUVEC en temps réel est une méthode simple, mais puissant pour la surveillance invasion. Il fournit des résultats en temps réel, ce qui est un avantage considérable sur les autres techniques traditionnelles qui s'appuient sur l'analyse du point final. Le dosage peut être modifié pour tester des médicaments, des anticorps, des ligands et des protéines que des inhibiteurs ou des stimulateurs de métastases. L'effet de différents agents sur l'endothélium / cellules cancéreuses diaphonie peut être évaluée aussi bien. Lors de l'introduction des agents exogènes, tels que les facteurs de croissance et des drogues dans les milieux de culture, il est important de veiller à ce qu'ils n'affectent pas l'intégrité de la monocouche HUVEC. Perturbation de la monocouche HUVEC peut être testée en introduisant l'agent exogène en l'absence de cellules envahissant, et d'assurer qu'il n'ya pas de changement de l'indice de la cellule. Ainsi, des contrôles appropriés doivent être inclus dans le cadre de la conception expérimentale.
Différentes lignées cellulaires montrent des courbes différentes cellules d'indice car ils forment une confmonocouche luent. La forme de la courbe, ainsi que la cellule d'indice maximale atteinte, est un type de cellule spécifique. Les cellules HUVEC montrent un aplatissement de l'indice de la cellule transitoire caractéristique 4-6 heures après l'ensemencement, suivie d'une autre stabilisation à un indice de la cellule supérieure après 16-18 heures. Par conséquent, il est important de laisser les cellules forment une monocouche confluente pendant au moins 18 heures avant l'addition des cellules tumorales.
Etant donné que l'indice de cellules est dépendant de l'environnement ionique sur l'électrode / cellule en interphase, différents facteurs tels que la morphologie cellulaire et la qualité des adhérences cellule-cellule d'influencer la cellule d'indice, en plus de la zone de fond bien couvert. Ainsi, la diminution de l'indice de la cellule, qui se produit lors de l'invasion des cellules tumorales, est une fonction de plusieurs facteurs, qui comprennent la rétraction des jonctions endothéliales et l'invasion des cellules tumorales ultérieure.
L'instrument xCELLigence est fabriqué dans trois configurations différentes: Analyseur de cellules en temps réel(RTCA) SP, RTCA MP et RTCA DP. L'instrument SP RTCA détient un E-plaque de 96 puits alors que l'instrument MP RTCA peut contenir jusqu'à 96 puits E-plaques simultanément six. Cela permet de criblage à haut débit de médicaments et de composés. Les expériences présentées dans cet article sont effectuées en utilisant l'instrument DP RTCA, qui peut contenir trois 16 et E-plaques. Chaque station de maintien E-plaque peut être utilisé indépendamment, ce qui permet à plusieurs utilisateurs d'exécuter simultanément des expériences. L'instrument RTCA DP peut également être utilisé pour étudier la migration en utilisant CIM-plaques. Ce sont des plaques de 16 puits avec des chambres supérieure et inférieure séparées par un téréphtalate de polyéthylène (PET) de la membrane avec une taille de pore médian de 8um. Les capteurs électroniques sont situés sur la face inférieure de la membrane poreuse de la chambre supérieure. La chambre inférieure sert de réservoir pour la chimio-attractive pour les cellules dans la chambre supérieure. Cependant, un avantage majeur de l'essai d'invasion HUVEC sur les CIM-plaques est que l'invasion des cellules tumorales dans l'ex-in'est pas limité par la taille des pores, comme l'invasion des cellules endothéliales dépend de la diaphonie entre les cellules tumorales et endothéliales.
Le dosage de l'invasion HUVEC peut également être effectuée sur ECIS instrument Z, fabriqué par Applied Biophysique (Troy, NY). L'instrument ECIS Z utilise une technologie semblable à celle de l'instrument de xCELLigence, avec des différences dans les configurations de modules et de l'électrode. Nous avons réalisé avec succès des essais d'invasion HUVEC en utilisant les tableaux de ECIS 8 puits. Il est important de noter que la superficie bien inférieure est plus grande dans les tableaux ECIS, qui exige un plus grand nombre de cellules endothéliales et tumorales d'être plaqué: 2,5 x 10 10 cellules de 5 et 1 x 5 respectivement.
Disclosures
Le coût de publication de ce manuscrit a été aimablement fourni par Roche Applied Science.
Acknowledgments
Ce travail a été généreusement financé par des fonds de la Fondation du cancer (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) et le NIH pour enfants (R01CA108641).
Nous tenons à remercier le Dr Anton Wellstein et les membres de son laboratoire pour partager leur expérience et nous aider à optimiser les méthodes présentées.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
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