Summary
Bu makalede, bir açıklar
Abstract
Malign hücrelerin metastatik yayılması konakçıda, uzak bölgelere bir taşıma aracı olarak kan dolaşımına endotel tabakasının temel membran, vasküler endotelyum, tümör hücrelerinin bağlanma, endotel birleşme geri çekilmesi ve tümör hücre istilası ve son olarak göç bozunma gerektiren 1-3. Bir kez dolaşım sisteminde, kanser hücrelerinin duvarları kapiller ve metastatik tümörler 4,5 oluşturmak için çevre dokuya extravasate uygun. Tümör hücre-endotelyal hücre etkileşiminin çeşitli bileşenleri, kanser hücreleri, insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) tek tabakalı bir zorlu tarafından in vitro olarak çoğaltılabilir. Elektron ve faz-kontrast mikroskobu ile yapılan çalışmalar in vitro etkinlikleri sırayla oldukça in vivo metastaz 6'da temsil etmektedir. Burada, izler ve gerçek zamanlı invas içinde rakamlarla bir elektrik-empedans tabanlı teknik açıklarhabis tümör hücrelerinin endotel hücrelerinin iyon.
Giaever ve Keese ilk hücre popülasyonunun elektrotlar 7,8 yüzeyi üzerinde büyümeye zaman empedans dalgalanmalar ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır. Roche tarafından üretilen XCELLigence enstrüman,, hücrelerin iyi altındaki alanın yaklaşık% 80 kapsayan bir altın mikroelektrot dizi ile kaplı bir kültür çanak eklemek ve yaymak gibi elektrikli empedans değişiklikleri ölçmek için benzer bir teknik kullanır. Hücreleri eklemek ve elektrot yüzeyine yayılmış olarak, 9-12 elektrik empedans bir artışa yol açar. Empedans hücreleri ile kaplıdır de doku kültürü toplam alanı ile doğrudan orantılı olan bir boyutsuz olarak adlandırılan hücre-göstergesi olarak gösterilir. Bu nedenle, hücre dizini, hücre yapışması, yayma, morfolojisi ve hücre yoğunluğunu izlemek için de kullanılabilir.
Bu makalede açıklanan işgali tahlil değişikliği esas alınmaktadırelektrot / hücre interfaz de elektrik empedans, malign hücrelerin bir nüfus olarak bir HUVEC tek tabaka (Şekil 1) ile işgal. Endotel kavşak bozulması, tümör hücreleri tarafından endotel tek tabaka ve yedek geri çekilmesi empedans büyük değişikliklere yol. Bu değişiklikler doğrudan tümör hücrelerinin invaziv kapasitesi ile ilişkili, yani, son derece agresif hücreleri tarafından işgali hücre empedansı ve tersi büyük değişikliklere yol. Endotel hücre-tümör hücresi etkileşim daha yakından taklit eden in vivo sürecinde, ve 2), veri gerçek elde edilir: 1) Bu teknik, Boyden odasının ve Matrigel tahlilleri gibi istila ölçme mevcut yöntemleri, üzerinde bir iki kat avantaj sağlar zaman ve diğer yöntemler için son nokta analizi aksine, daha kolay ölçülebilir.
Protocol
1. Hazırlık
- Tüm adımlar, bir doku kültürü kaputu steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
- XCELLigence istasyonu% 5 CO2 varlığında, 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir.
- Geçit 6 daha tercihen en fazla düşük geçiş HUVEC hücreleri, kullanın. Ayrıca, hücreleri daha fazla hasat sırasında birleşik% 75 daha olduğundan emin olun.
- HUVEC hücreleri, büyüme faktörleri, ek ve% 5 cenin sığır serumu içeren EGM-2 mermi kiti (Lonza'dan Biosciences) ile sulandırılır EGM-2 ortamında yetiştirilir.
- Tripsin tüm izleri, 200xg de hücre iplik bir kez PBS ile yıkama ve belirtilen hücre yoğunlukları bunları tekrar süspanse ederek hücre süspansiyonları çıkarılmalıdır.
- 37 ° C'de 1 saat süreyle% 0.1 jelatin ile kaplayın XCELLigence e-levhası 16 ° C ya da gece boyunca 4 ° C'de PBS ile plaka yıkayın ve 100μL sulandırılmış EGM-2 medya ekleyin. Arka plan ölçmek için XCELLigence sistemde boş bir okuma yapınhücrelerin yokluğunda empedansı.
2. HUVEC tek tabaka oluşturma
- Tripsinizasyon ile HUVEC hücreleri bir alt konfluent şişeye hasat. 2.5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir nihai yoğunluğa sulandırılmış EGM-2 ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri.
- 100μL EGM-2 medya içeren e-plaka kalibre bir arka plan her kuyuya, HUVEC hücre süspansiyonu (2.5 x 10 4 HUVEC hücreleri) 100μL ekleyin.
- Hemen XCELLigence aracı E-Plaka yerleştirin.
- Program XCELLigence yazılım 10 dakikalık aralıklarla empedans okuma gerçekleştirmek için.
- Bir tek tabaka oluşturacak kadar endotel hücreleri gibi (Şekil 2) hücre indeksi bir düzleşme kanıtladığı, 18-21 saat boyunca büyümesine izin.
3. Hücre ve veri normalleştirme işgal eklenmesi.
- Bir kez istikrarlı bir HUVEC tek tabaka bir son dens için trypsinization ve tekrar süspansiyon tarafından hasat tümör hücreleri, kurdu1 x 10 5 hücre / tümör hücreleri (RPMI ortam ya da DMEM% 10 FBS içeren gibi) yetiştirmek için kullanılan ortam içinde ml Sığ
- Pause empedans XCELLigence yazılım okuma ve istasyondan E-Plaka çıkarın.
- Aspirasyonu ile EGM-2 ortamı çıkarın. 1 x 10 hücre ihtiva eden 4 tümör hücre süspansiyonu 100μL ekleyin. Genel olarak, tümör hücre oranı 1:2.5: endotel hücreleri ekilmiş, tahlil için iyi çalışır. Bununla birlikte oran, tek bir hücre hatları için optimize edilebilir.
- Inkübatör XCELLigence sistemine E-plaka koyun ve 10 dakika aralıklarla empedans okumaları devam ediyor.
- Invasion tümör hücreleri işgal ederek endotel kavşaklar ve penetrasyon geri çekme nedeniyle hücre indeksi bir düşüş olarak önümüzdeki 6-12 saat üzerinden gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
- Tümör hücreleri istila ilavesi zaman sonuç normalize. XCELLigence yazılım, herhangi bir zaman noktasında ve sonuçlarına normalleşme izindoğrudan yazılım penceresinde görülebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Metastatik ve metastatik olmayan hücreler tarafından HUVEC tek tabaka işgali bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir. K7M2 metastatik osteosarkoma hücre hattıdır. Bu hücreler bu hücre hattı 13,14 invaziv özellikleri oluşturan, sitoskeletal bağlayıcı proteinin Ezrin yüksek düzeyde ifade eder. HUVEC hücreleri K7M2 hücreleri ile meydan olduğunda, 6 saat içinde elektrik direnci bir düşüş vardır. Elektrik direnci bu düşüş işgalci tümör hücreleri tarafından HUVEC tek tabaka işgali temsil eder. K12 hücre hattı ile, diğer taraftan, Ezrin çok daha düşük seviyelerde ifade eden ve 13 ve sonuçta daha az metastatik. Hücrelere bağlı veya HUVEC tek tabaka (Şekil 3) ile işgal edemiyoruz gibi direnci daha az dik açılan K12 hücreleri sonuçları ile HUVEC tek tabaka Zorlu.
Şekil 2. HUVEC tek tabaka oluşumu. HUVEC hücrelere tutunur ve jelatin kaplı altın elektrotlar üzerinde yayılmış gibi hücre indeksi değişiklikler. Konfluent tek tabaka oluşumu, 18 saat sonra hücre indeksi bir sabitleme ile temsil edilir.
Şekil 3,. K7M2 ve K12 osteosarkom hücreleri tarafından HUVEC hücrelerinin Invasion. Cel bir dik düşüşl-indeksi yüksek metastatik K7M2 hücrelerinin giriş birkaç saat içinde ortaya çıkar. K12 hücreleri, diğer yandan daha az metastatik ve verimli olarak K7M2 hücreleri gibi endotel tek tabaka nüfuz etmek mümkün değildir. Bu HUVEC tek tabaka K12 hücreleri ile meydan hücre endeksinde daha az dik düşüş ile temsil edilmektedir. Kontrol kanser hücrelerinin yokluğunda HUVEC tek tabaka empedans temsil eder. Deneyler, üç kopya halinde gerçekleştirildi.
Discussion
Gerçek zamanlı HUVEC işgali tahlil izleme işgali için basit ama güçlü bir yöntemdir. Bu son nokta analizi kullanan diğer geleneksel teknikleri üzerinde önemli bir avantaj olan, gerçek zamanlı sonuçlar sağlar. Tahlilinde test ilaçlarının, antikorlar, ligandlar ve metastazının önleyicileri veya uyarıcıları gibi proteinler için modifiye edilebilir. Kanser / endotel hücre çapraz konuşma farklı ajanların etkisi de değerlendirilebilir. Bu kültür ortamı içinde büyüme faktörleri ve uyuşturucu gibi eksojen ajanlar, tanıtan, bu onlar HUVEC tek tabaka bütünlüğünü etkilemez sağlamak için önemlidir. HUVEC tek tabaka bozulması hücreleri istila yokluğunda eksojen ajan tanıtan ve hücre indeksi bir değişiklik yoktur sağlayarak test edilebilir. Bu nedenle, uygun kontrollerin deney tasarımının bir parçası olarak dahil edilmelidir.
Bir conf biçimi olarak farklı hücre hatları farklı hücre-indeksi eğrileri göstermekluent tek tabaka. Eğri, hem de yüksek hücre-indeksi elde, şekli, hücre tipine bağlıdır. HUVEC hücreleri 16-18 saat sonra daha yüksek bir hücre dizindeki başka bir istikrar ardından, 4-6 saat tohumlama sonra hücre indeksi düzleştirme bir karakteristik geçici göstermektedir. Bu nedenle, bu hücrelerin, tümör hücrelerinin ilave edilmeden önce en az 18 saat boyunca konfluent tek tabaka oluşturacak izin vermek önemlidir.
Hücre indeksi elektrot / hücre interfaz iyonik ortamına bağlıdır, bu tür hücre morfolojisi ve hücre-hücre adezyon kalitesi gibi çeşitli faktörlere de kapalı alt alanında ek olarak, hücre dizini etkiler. Bu nedenle, tümör hücre istilasını üzerine oluşur hücre indeksi azalma, endotel birleşme ve takip eden tümör hücre istilası geri çekme dahil çeşitli faktörlere, bir fonksiyonudur.
XCELLigence araç üç farklı konfigürasyonlarda imal edilir: gerçek zamanlı hücre analiz(RTCA) SP, RTCA MP ve RTCA DP. RTCA MP alet 96-E-plakaları aynı anda altı tutabilir ise RTCA SP araçlar, bir 96-E-plaka tutar. Bu ilaçlar ve bileşiklerin yüksek verimli tarama için izin verir. Bu makaledeki deneyler üç 16-iyi E-plakaları tutabilir RTCA DP cihazı kullanılarak yapılmaktadır. Her E-plaka tutma istasyonu bağımsız olarak birden fazla kullanıcı aynı anda deneyler çalıştırmanıza olanak veren, çalıştırılabilir. RTCA DP araç aynı zamanda CIM-plakaları kullanarak göç incelemek için kullanılabilir. Bu 8um bir ortalama gözenek boyutu olan bir polietilen tereftalat (PET) membran ile ayrılan üst ve alt odaları ile 16 oyuklu plakalar vardır. Elektronik sensörler, üst bölmenin gözenekli zarın alt kısmında bulunur. Alt bölme odasının üst hücreleri için kemo-çekici için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Bununla birlikte, CIM-plakalar üzerinde HUVEC işgali tahlil önemli bir avantajı ise, bu eski içinde tümör hücre istilasını iendotel hücre işgali tümör ve endotel hücreleri arasında çapraz konuşma bağlıdır gibi s, gözenek boyutu ile sınırlı değildir.
HUVEC işgali tahlil da Uygulamalı Biyofizik (Troy, New York) tarafından üretilen, ECIS Z enstrüman üzerinde gerçekleştirilebilir. ECIS Z enstrüman dizi ve elektrot konfigürasyonları farklılıklar ile, XCELLigence araç benzer bir teknoloji kullanır. Biz başarıyla 8-iyi ECIS dizileri kullanarak HUVEC işgali deneyleri gerçekleştirdik. 2.5 x 10 5 ve 1 x 10 5 hücre sırası: Bu iyi alt yüzey alanı kaplama için endotelyal ve tümör hücrelerinin daha büyük bir sayı gerektirir ECIS dizileri, daha büyük olduğuna dikkat etmek önemlidir.
Disclosures
Bu yazının için yayın maliyet nazik Roche Applied Science tarafından sağlandı.
Acknowledgments
Bu çalışma cömertçe Çocuk Kanseri Vakfı (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Vakfı (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) ve NIH (R01CA108641) fon tarafından desteklenmiştir.
Biz Dr Anton Wellstein ve deneyim paylaşımı ve sunulan yöntemleri optimize etmek için bize yardımcı olduğunuz için onun laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
