Denne artikkelen beskriver en<em> In vitro</em> Teknikk for overvåking av kreftceller invaderer gjennom et monolag av endotelceller. Dataene er ervervet i sann tid som en funksjon av endringer i impedans på overflaten av elektrodene ved brønnbunnen.
Metastatisk spredning av ondartede celler krever nedbrytning av basalmembran, festing av tumorceller til vaskulært endotelium, inntrekking av endoteliale veikryss og endelig invasjon og migrering av tumorceller gjennom det endoteliale sjikt for å gå inn i blodstrømmen som et middel for transport til fjerntliggende steder i verts 1-3. En gang i sirkulasjonssystemet, kreftceller overholde kapillærveggene og extravasate til omkringliggende vev for å danne metastatisk svulster 4,5. De ulike delene av svulst celle-endotelceller interaksjon kan replikeres in vitro ved å utfordre en monolayer av menneskelige navlestrengsvenen endotelceller (HUVEC) med kreftceller. Studier som er utført med elektron-og fase-kontrast mikroskop tyder på at in vitro-sekvens av hendelser nokså vise in vivo metastatisk prosess 6.. Her beskriver vi en elektrisk impedans basert teknikk som overvåker og kvantifiserer i sanntid de invasion av endotelceller ved maligne tumorceller.
Giæver og Keeses først beskrevet en teknikk for å måle fluktuasjoner i impedans når en populasjon av celler som vokser på overflaten av elektrodene 7,8. Den xCELLigence instrument, produsert av Roche, benytter en lignende teknikk for å måle endringer i elektrisk impedans som celler feste og spredt i en kultur tallerken dekket med et gull microelectrode matrise som dekker omtrent 80% av arealet på bunnen av en brønn. Ettersom cellene feste og spredt på elektrodeoverflaten, det fører til en økning i elektrisk impedans 9-12. Impedansen blir vist som en dimensjonsløs parameter betegnet celle-indeksen, som er direkte proporsjonal med det totale areal av vev-kulturen godt som omfattes av celler. Derfor kan den celle-indeksen brukes til å overvåke celle adhesjon, spredning, morfologi og celletetthet.
Invasjonen analysen beskrevet i denne artikkelen er basert på endringeri elektrisk impedans ved elektroden / celle interfase, som en populasjon av maligne celler invaderer gjennom en HUVEC monolaget (figur 1). Avbrudd av endotelceller veikryss, tilbaketrekking av endotelial monolag og utskifting av kreftceller føre til store endringer i impedans. Disse endringene direkte korrelerer med invasiv kapasitet av kreftceller, dvs. invasjon av høyt aggressive celler vil føre til store endringer i celle impedans og vice versa. Denne teknikken gir en dobbel fordel i forhold til eksisterende metoder for måling av invasjon, slik som Boyden kammer og Matrigel assays: 1) endotelcelle-tumor celle interaksjon nærmere etterligner in vivo prosess, og 2) den data som er oppnådd i den virkelige tid og er mer lett å kvantifisere, i motsetning til slutt-punkt-analyse etter andre metoder.
The real-time HUVEC invasjon analysen er en enkel, men kraftig metode for overvåking invasjon. Det gir resultater i sanntid, som er en betydelig fordel i forhold til andre tradisjonelle teknikker som er avhengige av ende-punkt-analyse. Analysen kan bli endret for å teste narkotika, antistoffer, ligander og proteiner som hemmer eller stimulatorer av metastaser. Effekten av ulike agenter på endotelial / kreftcelle cross-talk kan vurderes i tillegg. Ved innføring av eksogene agenter, for eksempel vekstfaktorer og narkotika i kultur media, er det viktig å sikre at de ikke påvirker integriteten til HUVEC monolayer. Forstyrrelse av den HUVEC monolaget kan testes ved å innføre eksogene middel i fravær av invaderende celler, og å sikre at det ikke er noen forandring i celle-indeksen. Således bør egnede kontroller inkluderes som en del av den eksperimentelle design.
Forskjellige cellelinjene demonstrere ulike celle-indeksen kurver som de danner en confluent monolag. Formen på kurven, så vel som den maksimale celle-indeks oppnås, er celle-typespesifikk. HUVEC-celler viser en karakteristisk forbigående utflating av celle indeks 4-6 timer etter tilsetningen, etterfulgt av en annen stabilisering ved en høyere celle indeks etter 16-18 timer. Derfor er det viktig å la cellene danne et konfluent monolag i minst 18 timer før tilsetning av tumorceller.
Siden cellen indeksen er avhengig av det ioniske miljø ved elektrode / celle interfase, forskjellige faktorer, slik som celle-morfologi og kvaliteten av celle-celle adhesjon påvirke celle-indeks, i tillegg til området av brønnbunnen dekket. Dermed er den reduksjon i celle-indeksen, som skjer ved tumorcelle-invasjon, er en funksjon av flere faktorer, som omfatter tilbaketrekking av endoteliale veikryss og påfølgende tumor celle invasjon.
Den xCELLigence instrumentet er produsert i tre forskjellige konfigurasjoner: sanntid celle analysator(RTCA) SP, RTCA MP og RTCA DP. Den RTCA SP instrumentet har en 96-brønnen E-plate mens RTCA MP instrumentet kan lagre opp til seks 96-brønnen E-plater samtidig. Dette gir høy gjennomstrømming screening av narkotika og forbindelser. Forsøkene i denne artikkelen er utført ved hjelp av RTCA DP instrument, som kan holde tre 16-brønners E-plater. Hver E-plate beholdning stasjon kan være uavhengig operert, noe som gjør at flere brukere å kjøre eksperimenter samtidig. Den RTCA DP Apparatet kan også brukes til å studere migrering CIM-plates. Disse er 16-brønners plater med øvre og nedre kammere adskilt av en polyetylentereftalat (PET)-membran med en gjennomsnittlig porestørrelse på 8um. De elektroniske sensorer er plassert på undersiden av den porøse membran i det øvre kammer. Det nedre kammeret tjener som et reservoar for kjemoattraktant for cellene i det øvre kammer. Imidlertid er en stor fordel med den HUVEC invasjon analysen over CIM-platene som tumor celle invasjon i det tidligere jegr ikke begrenset av porestørrelse, som endotelcelle invasjon avhenger av krysstale mellom de tumor-og endotelceller.
Den HUVEC invasjon Målingen kan også utføres på ECIS Z instrument, fremstilt av Applied Biofysikk (Troy, NY). Den ECIS Z instrument benytter en teknologi som ligner på xCELLigence instrument, med forskjeller i matrisen og elektrode konfigurasjoner. Vi har vellykket utført HUVEC invasjon analyser ved hjelp av de åtte-brønners ECIS arrays. Det er viktig å merke seg at den vel-bunn overflateareal er større i de ECIS matriser, som krever et større antall av endotelceller og tumor celler som skal pletteres: 2,5 x 10 5 og 1 x 10 5 celler hhv.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av midler fra Barnas Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) og NIH (R01CA108641).
Vi vil gjerne takke Dr. Anton Wellstein og medlemmer av hans laboratorium for å dele sine erfaringer og hjelpe oss til å optimalisere presentert metoder.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |