Summary
一种有效的方法来评估钩端螺旋体蛋白质表面暴露描述。该方法是专门设计，以避免破坏脆弱的钩体细胞的外膜。这种技术需要雇用几个阴性对照，以评估外膜的完整性和特异性抗体反应。
Abstract
细菌表面蛋白与宿主细胞的直接接触和吸收营养物质从环境1的参与。出于这个原因，细胞定位，可以提供细菌蛋白质的功能作用的见解。表面细菌蛋白质的本地化是对识别致病的机制，涉及的致病因素关键步骤。
分馏2-5钩端螺旋体膜的方法可为一定阶级的外膜蛋白（OMPS），如脂蛋白与跨膜外膜蛋白，有选择性的，因此导致的错误分类。这可能是由于结构上的差异，以及它们是如何相关的外膜。脂蛋白与膜通过脂基团之间的N -末端（3脂肪酸）和脂质双层磷脂6，7的疏水相互作用。相比之下，跨膜外膜蛋白通常集成在一个筒状结构，8，9排列的双亲性β-张成脂质双层。此外，在外膜蛋白的存在并不一定能保证，暴露在表面上的蛋白质或它的域。 Spirochetal外膜被称为脆弱，因此必要的方法，涉及温柔操纵子表面蛋白细胞和列入控制评估外膜的完整性。
在这里，我们目前的免疫荧光法（IFA）的方法来直接评估完好leptospires的蛋白质表面暴露。这种方法是基于对钩体表面蛋白抗原特异性抗体识别。在这里，特定抗体OmpL54 10 detetcted aftero约束力的本地人，表面抗原决定簇暴露。抗体反应的比较完整的与透细胞，使细胞分布进行评估，并与否的一种蛋白质是钩体表面选择性。应分摊的外膜的完整性，使用一个或多个地下蛋白质，最好在位于周质抗体。
表面IFA方法可用于分析任何钩端螺旋体特异性抗体的蛋白质表面暴露。的实用性和方法的限制，取决于是否能够绑定到本地的抗原表位的抗体。由于抗体往往提出对重组蛋白抗原表位，原生的，暴露于表面的蛋白质可能无法识别。然而，表面的IFA方法是一个完整的细菌表面成分研究的宝贵工具。这种方法不仅可应用于leptospires而且其他螺旋体和革兰氏阴性菌。更强的外膜蛋白的表面接触的结论，是一个全面的方法，涉及多种细胞定位方法推荐10。
Protocol
1。 钩端螺旋体固定玻片
- 钩端螺旋体是一种类BSL2病原体。活细胞的工作，它需要适当的处理，如戴手套，实验室外套，并在无菌罩移液步骤。
- 在EMJH medium11成长的钩端螺旋体，辅以1％兔血清在30 ° C，直到他们达到月中下旬数期约6天（5 × 10 8细胞/ ml密度为5 × 10 7） 。
- 〜2000年7分钟在室温XG离心收获的文化。
- 移除吸上清，轻轻重悬沉淀磷酸盐缓冲液（PBS）-5毫米氯化镁2，PH7.2到终浓度为5 × 10 8个细胞/ ml 。
- 加入1 ml的细胞悬液，每孔两腔玻片和孵化在30 ° C至80分钟让细胞坚持。
- 小心地取出液体含有未结合的细胞吸。
- 修复剩余的细菌玻片，加入1 / 2％多聚甲醛PBS - 5毫米氯化镁2毫升。孵育40分钟，在30 ° C.这些幻灯片将用于评估暴露于表面的蛋白质。
- 评估子表面蛋白对于控制幻灯片，通透冰冷的甲醇1毫升/ 100％固定的外膜。在-20 ° C孵育20分钟。甲醇行为在几个方面：permeabilizes外膜，denaturates的蛋白质，并修复细胞玻片。
- 取出固定吸剂。
2。标记的特异性抗体
- 阻止非特异性结合，通过加入1毫升/封闭液（DIFCO钩端螺旋体浓缩EMJH）。在30 ° C孵育90分钟。
- 稀释的特异性抗体（免疫兔血清或小鼠单克隆抗体，这里多克隆兔血清具体OmpL54 10，FlaA1 12，和OmpL1 13）和免疫前兔血清或鼠标腹水抗体（作为阴性对照时使用）不包含在封闭液。每个抗体的稀释液有经验取决于抗体滴度，抗原抗体反应，在细胞中的蛋白丰度加以确定。通常的范围是1:50到1:600。
- 删除愿望封闭液，并添加1毫升/孔的稀释的抗体。
- 在30 ° C孵育1小时。
- 移除吸液和洗井三次，用PBS（1毫升/孔）。
3。可视化的leptospires
- 添加1毫升/清楚的Alexa Fluor 488标记（任羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）抗体稀释1:2000和荧光核酸染色，4'6 - diamidino - 2 -苯基吲哚盐酸盐（ DAPI）的稀释到终浓度为0.25微克/毫升封闭液。此步骤可确保检测抗体结合的螺旋体抗体独立的约束力，分别的存在。
- 孵育30℃，45分钟的幻灯片。
- 移除吸出的液体和两次用PBS，一旦洗井，用蒸馏水（1毫升/孔）。
- 删除商会及胶条从载玻片和空气干燥〜10分钟。
- 延长黄金防褪色的安装介质（2 × 20μL每张幻灯片）和一个24 × 50毫米盖玻片。
- 在室温下在黑暗中孵育过夜。这一步是必要的，以便安装介质固化（硬化）。
- 用指甲油密封盖玻片。
- 可视化染色荧光显微镜使用青色/蓝色为DAPI染色检测过滤器和一个绿色的检测过滤器的Alexa Fluor 488。为了确保准确的样本的代表性是，确保您评估每个样本的整个腔面积。
- 记录每个样品的代表性成像领域的数据。当成像的Alexa Fluor 488荧光，使用的所有样品相同的曝光时间。使用一致的曝光时间，以便更准确的比较与测试抗原与控制的结果。
4。代表性的成果：
钩端螺旋体使用对表面和亚表面蛋白的抗体细胞表面的IFA结果的例子如图2所示。一个测试被认为是积极的，当大量的荧光是一个感兴趣的蛋白质表面暴露（图2A）在具有完整leptospires的样品检测。通常情况下，在积极的测试（在这里，表面暴露OmpL54），大致相同的荧光强度观察完好和通透的细胞（图2A），它必须包括针对地下使用的抗体阴性对照为外膜的完整性，最好是周质蛋白（如钩端螺旋体FlaA1，图2B）。只有当数据表明，外膜保持完好杜里吴实验，即对一个子表面蛋白的抗体还没有反应过来（无荧光或荧光弱得多透样品图。2B）完整的细胞，它可以得出结论，感兴趣的蛋白质（S）表面暴露。列入作为一个额外的负面控制与免疫前血清（多克隆抗体的情况下）的实验是必要的，明确的数据，应该不会产生大量荧光完好或通透的细胞（图2A，2C）。 DAPI染色是必要的可视化时，结果为阴性（没有的Alexa Fluor 488荧光）观察leptospires。碘化丙啶Counterstaining到DAPI是一个可以接受的替代品。
这种方法是定性的，而不是明亮的荧光定量，可能是由于多个表面，暴露在一个相对平等的丰盈的其他抗原的抗原，但较少的表面暴露的抗原表位识别的抗原表位。因此只能用荧光强度比较相同的抗体，如完好与透细胞和不同的蛋白质之间没有荧光强度，反应。这个区别是重要的，当一个含糊的结果是取得显着减少的荧光比透性细胞（图2C）在完整的细胞中观察到。这样的结果表明，蛋白质在分型面的位置（完整细胞与一些非特异性背景染色），抗体优先是具有约束力的非本地的暴露后甲醇通透或蛋白质的抗原表位，可能有多个本地化网站所描述的ERP和ELP蛋白质的另一种螺旋体，莱姆病螺旋 体 14 。在这两种情况下，像这样一个含糊的IFA结果要求，如表面生物素或表面蛋白水解的替代方法，以确定是否感兴趣的蛋白质表面暴露或不10。
图1。表面钩端螺旋体螺旋体免疫荧光检测的流程图。首先，1 ml的细胞悬液加入到每孔以及两玻片（每次实验至少有两个幻灯片），孵育leptospires坚持。下一步，leptospires固定在玻片完整的外膜（OM）和冷甲醇1毫升/ 100％的样品与通透OM样品中加入1 / 2％多聚甲醛（PFA）毫升。接下来，leptospires孵育认识到，随着地下蛋白（小学AB公司）在30 ° C为90分钟的对照抗体表面暴露蛋白的抗体。然后，初级抗体检测1毫升/的Alexa Fluor 488标记的二抗孵育。最后，荧光显微镜观察细胞。
图2表面免疫分析钩端螺旋体蛋白质。钩端螺旋体螺旋体免疫和免疫前的血清，探讨，并用DAPI染液配对阴性结果证明螺旋体的存在。绿色荧光过滤器是用来检测的Alexa Fluor 488标记的二级抗体结合表面暴露的蛋白质和蓝色/青色荧光过滤器检测的DAPI结合到细胞的DNA。一）Leptospires探索与认识的一个暴露表面的蛋白质，OmpL54 10抗体。二）细胞探测与打击地下一个周质蛋白，FlaA1（阴性对照）的抗体。三）探讨，OmpL1钩端螺旋体孔蛋白抗体的细胞。绑定leptospires兔血清检测的Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG片段。所有图像都采取后4秒的长时间曝光。
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Discussion
我们的表面IFA技术是用来展示各种borrelial 15，16和钩端螺旋体12，17种蛋白质的表面接触的相似。这里描述的，旨在最大限度地减少操纵细胞在努力保持外膜的完整性，同时利用优势钩端螺旋体细胞的倾向，坚持以玻片表面IFA方法的细节。该方法涉及的多聚甲醛浓度较低（2％和4％），外层膜稳定缓冲液（PBS 5毫米氯化镁 2）和更少的洗涤步骤洗衣机比以前公布的协议12， 17。此外，我们的表面IFA方法强调的重要性，准确的数据解释所必需的控制。该方法的局限性在于它需要的是能够认识到暴露于表面的抗原表位蛋白（S）的特异性抗体的可用性。在某些情况下，由其他表面的蛋白质或脂多糖空间位阻可以防止抗原抗体的形成。然而，表面的IFA方法是一个相对简单的技术，直接评估的蛋白质表面暴露，可以用来作为一个独立的方法，或在与其他技术，如免疫标识，表面水解，等演唱会
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是支持公共卫生服务补助金的AI - 34431（DAH）由美国国立过敏和传染病研究所和VA医学研究基金（DAH）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
