Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten
Summary
Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.
Abstract
Ein grundlegendes Ziel der Grundlagenforschung und der klinischen Neurowissenschaften ist es, ein besseres Verständnis der Identität, der molekularen Zusammensetzung und Muster der Konnektivität, die charakteristisch für Neuronen im normalen und erkrankten Gehirn. Gegen diese, hat einen großen Aufwand auf den Aufbau von hochauflösenden neuroanatomischen Karten 1-3 gelegt. Mit dem Ausbau der molekularen Genetik und der Fortschritte in der Lichtmikroskopie hat die Fähigkeit, nicht nur neuronale Morphologie Abfrage kommen, sondern auch die molekularen und zellulären Zusammensetzung der einzelnen Neuronen und ihre zugehörigen Netze 4. Große Fortschritte in der Fähigkeit zu markieren und zu manipulieren Neuronen durch transgenen und Gen-Targeting-Technologien in das Nagetier jetzt die Ermittler ein "Programm" neuronalen Teilmengen nach Belieben 5-6. Wohl hat einer der einflussreichsten Beiträge zur zeitgenössischen Neurowissenschaften der Entdeckung und Klonierung von Genen, fluoreszierenden Proteinen (FPs) in marinen Wirbellosen 7-8, zusammen mit ihren nachfolgenden Engineering zu einer ständig wachsenden Toolbox von entscheidender Reporter 9 Ertrag worden. Ausnutzen Zelltyp-spezifische Promotoraktivität gezielte FP Ausdruck in diskrete neuronale Populationen fahren jetzt bietet neuroanatomischen Untersuchung mit genetischen Präzision.
Engineering FP Expression in Neuronen hat erheblich unser Verständnis von Hirnstruktur und-funktion verbessert. Allerdings Bildgebung einzelnen Neuronen und die damit verbundenen Netzwerke in tiefen Hirngewebe oder in drei Dimensionen, blieb eine Herausforderung. Aufgrund der hohen Fettgehalt, ist Nervengewebe eher undurchsichtig und Exponate Autofluoreszenz. Diese inhärenten biophysikalischen Eigenschaften machen es schwierig zu visualisieren und Bild fluoreszenzmarkierten Neuronen bei hoher Auflösung mit Standard-epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie über Tiefen von einigen zehn Mikrometern. Zur Umgehung dieser Herausforderung Ermittler oft beschäftigen serielle Dünnschicht-Imaging-und Rekonstruktionsverfahren 10, oder 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 11. Aktuelle Nachteile dieser Ansätze sind die damit verbundenen arbeits-Gewebe Zubereitung oder kostspielig Instrumentierung bzw..
Hier präsentieren wir eine relativ schnelle und einfache Methode, um fluoreszenzmarkierte Zellen in festen semi-dicke Maus Hirnschnitten visualisieren durch optische Clearing-und Imaging. In der beigefügten Protokoll beschreiben wir die Methoden aus: 1) Fixierung Hirngewebe in situ über intrakardiale Perfusion, 2) Zerlegung und Entfernung der gesamten Gehirns, 3) stationären Gehirn Einbettung in Agarose, 4) Präzision semi-dicke Scheibe Vorbereitung mit neuen Vibratom Instrumentierung , 5) Clearing Hirngewebe durch eine Glycerin-Gradienten, und 6) Montage auf Glas-Objektträger für die Lichtmikroskopie und Z-Stapel-Rekonstruktion (Abbildung 1).
Für die Herstellung Hirnschnitten wir implementiert ein relativ neues Stück Instrumentierung als "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Dieses Instrument ist eine semi-automatische Mikrotom mit einem motorisierten Voraus-und Blade-Vibrations-System mit Funktionen in der Funktion ähnlich zu anderen vibratomes ausgestattet. Im Gegensatz zu anderen vibratomes, ist das Gewebe geschnitten werden in einer Agarose-Plug in einem Zylinder aus rostfreiem Stahl montiert. Das Gewebe wird extrudiert gewünschten Dicken aus dem Zylinder, und schneiden in den zukunftsgerichteten Weiterentwicklung vibrierender Klinge. Die Agarose-Stecker / Zylinder-System ermöglicht eine reproduzierbare Gewebe Montage, Ausrichtung und präzise Schnitte. In unseren Händen, das "Compresstome 'liefert hochwertige Gewebeschnitten für die Elektrophysiologie, Immunhistochemie und direkte festen Gewebe Montage-und Imaging. Kombiniert mit optischen Lichtung, hier zeigen wir die Erstellung von semi-dicke feste Hirnschnitten für hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung.
Protocol
Discussion
Angesichts der weit verbreiteten Anwendung der unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen zu neuronalen Teilmengen für die Untersuchung über die Lichtmikroskopie, die Notwendigkeit, rasch Bildschirm, Bild-und Analyse neuronaler Netze innerhalb intakten Hirngewebe geworden unschätzbare Ziel.
Technische Fortschritte in der Entwicklung von benutzerfreundlichen viralen Vektoren in vivo Elektroporation Techniken und genetisch veränderte Mausstämme bietet nun eine scheinbar unbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung durch die McNair-Stiftung, NARSAD und NINDS gewähren R00NS064171-03 finanziert.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
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