Summary
여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
모두 기초 및 임상 신경 과학에 대한 근본적인 목표는 더 신원, 분자 메이크업, 그리고 정상과 질병 뇌 모두에서 뉴런에 특징 아르 연결의 패턴을 이해하는 것입니다. 이 무렵, 노력의 다량은 고해상도 neuroanatomical지도 1-3 건물에 위치하고 있습니다. 분자 유전학 가벼운 현미경의 진보의 확장의 연결 morphologies뿐만 아니라 쿼리 수있는 능력을 올뿐만 아니라, 개별 뉴런과 연결된 네트워크 4 분자 및 세포 메이크업이되고있다. 설치류의 유전자 변형과 유전자 타겟팅 기술을 통해 뉴런을 표시하고 조작할 수있는 능력의 주요 발전은 이제합니다 5-6에서 '프로그램'의 연결 집합에 수사관을 허용합니다. 확실하게, 현대 신경 과학에 가장 영향력있는 공헌 중 하나는 필수 기자의 끊임없이 확장 도구 상자 9 항복을 7-8, 그들의 후속 기술과 함께 해양 무척추 동물에 형광 단백질 (FPS) 인코딩 유전자의 발견 및 복제되었습니다. 이산의 연결 인구에서 타겟 FP 표현을 드라이브에 활용 세포 유형의 특정 발기인 활동은 이제 유전자 정밀 neuroanatomical 조사를 내실수가 있었죠.
뉴런의 엔지니어링 FP 표현은 크게 뇌의 구조와 기능에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 그러나, 깊은 뇌 조직에, 또는 3 차원 영상 개별 뉴런과 관련 네트워크, 도전 남아있다. 높은 지질 내용으로 인해, 신경 조직 오히려 불투명 전시 자동 형광입니다. 이러한 고유 biophysical 속성은 어려운 미크론 수십의 깊이 이상의 표준 epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 높은 해상도에서 찬란 분류 뉴런을 시각화 및 이미지를합니다. 이 과제의 수사를 회피하기 위해서는 종종 일련 박막 섹션 이미징 및 재건 방법 10, 또는 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 11 사용합니다. 이러한 방식으로 현재의 단점은 각각 관련 노동 집약적인 조직을 준비하거나, 비용 금지 기기입니다.
여기서는 광학 삭제 및 이미징에 의해 고정 세미 두께 마우스 뇌 조각의 찬란 레이블 세포를 시각화하기 위해 상대적으로 신속하고 간단한 방법을 제시한다. 첨부된 프로토콜에서는의 방법을 설명합니다 intracardial 재관류, 2) 해부 및 전체 두뇌의 제거, 3) 아가로 오스, 4 고정 뇌 포함) 새로운 vibratome 장비를 사용하여 정밀 세미 두꺼운 슬라이스 준비를 통해 현장에서 1) 고정 뇌 조직 , 5) 정산 두뇌 글리세롤 기울기를 통해 조직, 그리고 6) 가벼운 현미경과 Z - 스택 재건 (그림 1) 유리 슬라이드에 장착.
뇌 조각을 준비하는 동안 우리는 장비의 새로운 작품은 'Compresstome'VF - 200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html)를 호출 구현했습니다. 이 악기는 다른 vibratomes 함수를 유사한 기능을 갖춘 전동 사전 및 블레이드 진동 시스템을 갖춘 세미 자동 마이크로톰입니다. 다른 vibratomes 달리 얇게하는 조직은 스테인레스 스틸 실린더 내에 아가로 오스 플러그인에 마운트됩니다. 조직 원하는 실린더의 두께로 압출하고, 앞으로 발전 진동 칼날에 의해 절단. 아가로 오스 플러그 / 실린더 시스템은 재현성 조직이 장착 정렬 및 정밀 가공을위한 수 있습니다. 우리 손 안에있는 'Compresstome'수율은 전기 생리학, immunohistochemistry를위한 고품질의 조직 슬라이스하고, 직접 고정 조직 실장 및 이미징. 광학 삭제와 함께, 우리가 고해상도 형광 이미징을위한 세미 두께 고정 뇌 조각의 준비를 보여줍니다.
Protocol
1. 원위치 뇌 고정에
* 인산염 가득한 10 ML 주사기 (28 게이지 바늘)을 준비 호수 (PBS)가 버퍼.
* PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 가득 10 ML 주사기 (28 게이지 바늘)을 준비합니다. 게시물에 대한 고정 PFA / PBS의 지역은 추가 5-10 ML.
- Avertin 또는 Nembutal의 치사량과 실험 마우스 intraperitoneally을 주사.
- 마우스가 진정되면 에탄올과 복부를 습식 및 코크, 왁스, 또는 해부 핀을 사용하여 실리콘 엘라스토머와 계층 트레이의 하단에 마우스를 확보. 최대 마주 복부와 표면에 푸르 포스를 확보 - 가능한 한 그들처럼 넓은 확산.
- 흉골의 수준에서 집게로 피부를 잡아, 간장을 폭로 십자형 했네요. 갈비와 횡경막 통해 옆으로 후 잘라. 리브 조직 플랩을 제거하고 심장에 액세스할 때까지 계속 절단.
- 피어스 또는 싹둑 순환 혈액을 유출에 대한 권리 아트리움.
- 좌심실을 통해 PBS의 재관류에 의해 순환 시스템에서 잔류 혈액을 플러시.
- 같은 바늘 구멍을 액세스, 좌심실을 통해 PBS / PFA의 후속 재관류에 의해 전체 마우스를 해결할 수 있습니다.
2. 해부 및 뇌 추출
- 두개골을 노출 anteriorly 피부를 당기는 다음, 귀 운하와 눈 주위 궤도 절단하여 머리, 목, 그리고 두개골의 피부를 제거합니다.
*) 2.5 단계 2.2)의 그림에 대한 그림 2 참조 - 뼈 가위를 사용하여, 눈의에서 비강 turbinate 뼈를 통해 소켓을 십자형으로 잘라. 각 측면에 대해이 작업을 수행합니다. 크로스컷은 눈과 후각 구근을 앞쪽에 있어야합니다.
- 각 귀 운하에서 안구 소켓에 세로로 잘라.
- 작은 해부 가위를 사용하여, 다른 한 귀로 운하에서 소뇌를 overlying 후두 골 판 잘라.
- 같은 해부 가위로 후각 전구의 수준에 정중선을 따라 anteriorly 했네요.
- 포셉 사용하여 뼈를 리프팅 때 두뇌가 그대로 남아 있도록하는 결합 조직을 제거하는 간병, 두뇌에서 각 뼈 플레이트를 제거합니다.
- 싹둑 광 및 두개골 신경은 상위 경추의 척추 잘라 및 정착액에 머리를 제거합니다.
- 4 1-2 시간에 대한 사후 수정 ° C. 워시 3 회 15 분 PBS의 각.
3. 아가로 오스의 삽입
- 용융 2% 고강도, 낮은 - 젤 포인트 아가로 오스 유형 IB (시그마 카탈로그 번호 : A0576) 전자렌지와 PBS 살린 인치
- 테스트 튜브에 녹은 아가로 오스를 전송합니다. 온도 평형까지 따뜻한 보육 또는 물 목욕 (40 ° -41 ° C가)에 넣어 테스트 튜브.
- cyanoacrylate 접착제 (그림 3A)와 표본 주사기의 플런저에 접착제 고정 뇌 조직. 뇌 조각의 아가로 오스 고리의 이후 릴리스를 촉진하기 위해 뇌 조직의 표면에 포화 자당 - PBS 솔루션의 얇은 레이어를 브러쉬.
- 플런저 주택 (그림 3B)으로 뇌 조직과 플런저를 그립니다.
- 피펫 또는 뇌 조직을 덮고, 플런저 주택에 따뜻한 아가로 오스를 부어. 아가로 오스로 기포를 트래핑하지 마십시오. 아가로 오스의 공기 방울은 슬라이스의 품질을 손상됩니다.
- 감기 (-25하기 위해 0 ° ° C) 1 분 아가로 오스 (그림 3C)을 설정 놀아요 차단합니다.와 표본 주사기 클램프
4. Compresstome과 뇌의 슬라이스를 Sectioning
- Compresstome (그림 3D)으로 뇌 조직을 포함하고있는 표본 주사기 조립.
- 표본 주사기의 콘센트 (그림 3E)와 밀접하게 면도날의 가장자리를 맞춥니다.
- PBS 용액으로 버퍼 탱크를 채우십시오.
- 표본 주사기의 아가로 오스 - 뇌 조직 블록을 밖으로 돌출 앞으로 마이크로 미터 한 조각의 두께를 돌리세요.
- sectioning 과정을 시작하기 위해 Compresstome의 제어 장치에있는 '시작'버튼을 누르십시오.
- 원하는 조각이 두께를 결정에서 구할 때까지 4.5) 단계 4.4) 반복합니다.
- 튜브 또는 PBS (그림 3 층)으로 가득 얼룩의 우물에 브러시 또는 피펫과 함께 추수 뇌 슬라이스.
5. 광학 지우기
- 글리세롤의 권 솔루션 : PBS 75% 권을 준비합니다.
- 수집된 두뇌 조각에서 PBS 세척의 절반 볼륨에서 (또는 피펫) 하거라.
- 글리세롤 / PBS로 제거 볼륨을 다시 추가합니다.
- 4 부드러운 혼합과 평형을 허용 ° C 조각 싱크까지.
- 최종 글리세롤 농도가 75 %에 도달할 때까지) 6.4 단계 6.2) 반복합니다.
- PBS에 90 % 글리세롤과 솔루션을 교체하고 평형 수 있습니다.
* 참고 : 글리세롤 솔루션을 추가하는 동안 공기 방울을 소개 안됩니다. 기포가 균일 equilibra 방해하기 때문에, 천천히 솔루션을 붓고 부드럽게 섞는다기하며 장착 슬라이드로 진행됩니다.
6. 슬라이스는 이미지에 대한 마운트
- 마이크로 슬라이드 (Superfrost 플러스 25의 볼 수있는 영역에 맞게 개방 사각형으로 양면 씰 접착제 (SA - S - 1L, 그레이스 바이오 연구소) 컷 X 75 X 1mm, 고양이. # 48311-703, VWR ) 2~3mm 다양한 측면과 함께.
- 피펫이나 페인트를 사용하여 접착 테이프 사각형의 중심 안쪽 뇌의 슬라이스를 놓습니다. 부드러운 흡인과 초과 글리세롤을 제거합니다.
- 페인트 브러쉬로 원하는 순서대로 슬라이드 뇌 조각 마련.
- 접착 테이프로 부드럽게 낮은 커버 유리 (24 X 60mm, 고양이. # 48383-139, VWR), 공기 방울을 소개하지 돌보는. 부드럽게 접착제 테이프와 접촉을 보장하기 위해 커버 유리에 압력을 적용합니다.
- 슬라이드와 coverglass 사이의 가장자리에서 초과 글리세롤을 대기음.
- 투명 매니큐어를 사용하여 밀봉 슬라이드 및 coverslip.
- 이미징 전에 건조, 또는 4 슬라이드 상자에 장기간 저장하는 허용 ° C.
7. 대표 결과 :
가공, 이미징, 그리고 찬란 표시 뇌 조직을 분석은 신경 생물학의 연구에 필수가되었습니다. 이러한 조사의 대부분은 정교한 유전자 조작 모두 낮은과 고해상도 이미지를 분석하여 다음 타겟의 연결 하위 집합에서 기자 표현을 얻기 위해 필요합니다. 종종 실험 및 기술 한계는 불가능 같은 동물에서 이러한 유형의 데이터를 얻을, 또는 신속한 방식으로합니다. 이 도전에 형광 이미징 에이즈에 대한 광학 - 삭제, 세미 두께 뇌 부분의 준비. 유전자 조작 광견병 바이러스에 표시된 그대로 두꺼운 뇌 슬라이스의 예제는 표현 EGFP 수 있도록 설계하고, epifluorescent 및 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 그림 4에 나와 있으며, 각각 5 그림. epifluorescent 이미징을 위해 우리는 Leica M205 FA를 사용하고, 공촛점 이미지 수집을위한 우리 자이스 혈구 LSM 510를 사용합니다. 첨부된 프로토콜의 상대 단순 때문에,이 방법은 하루도 채 안의 처리 시간과 형광 기자를 표현하는 조직에서 유용하게 이미지 데이터를 항복 수 있으며, 모두 낮은과 높은 해상도 가벼운 현미경과 호환됩니다.
조사 추가 사후 라벨 방법, immunohistochemical 얼룩을 통합하거나 얇은 섹션을하도록 선택한 경우, 프로토콜은 따라 길게. 그러나, 위에서 설명한 방법은 그대로 두뇌의 핵심 기자 표현의 심사 패턴 간단하고 상대적으로 높은 처리량 방법을 나타냅니다.
그림 1. 고정, 해부, 깔끔히, 삭제하고 준결승 두께 뇌 조각의 설치 절차를 diagraming 플로우 차트.
그림 2. 그대로 마우스 머리를 추출하는 연속 절삭 단계 다이어그램.
그림 3. Compresstome를 사용하여 뇌 조직을 탑재하고 슬라이스하는 방법. superglue를 사용하여 플런저를 절단에 뇌 조직의) 배치. B) 아가로 오스의 포함을위한 플런저에 탑재된 뇌 조직 아래 그리기. C) 냉장 압축 블록을 사용하여 아가로 오스 두뇌 플러그를 응고. Compresstome 절단 챔버로 아가로 오스 두뇌 플러그와 플런저의 D) 삽입. 플런저 장치에 razorblade의 E) 정렬. Compresstome 버퍼 챔버로 뇌 조각의 F) 커팅 및 수집.
그림 4. 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 표현하는 전두엽 피질을 통해 글리세롤 - 삭제 뇌 조직에서 두꺼운 단면의 빛 현미경 이미지. 마우스 두뇌를 통해 A) 코로나 슬라이스 (두께 200 음)은 바이러스 벡터 표현 EGFP으로 표시하고 epifluorescent 입체경을 사용하여 낮은 해상도에서 몇 군데. 스케일 바, 2mm.
그림 5. 찬란 분류 층 5 / 삭제 두꺼운 뇌 슬라이스 6 대뇌 피질의 뉴런의 높은 배율 이미지. 강조 표시 영역 (그림 4)을 통해 최대 프로젝션 Z - 스택 (두께 150 음)의) 고해상도 공촛점 이미지. 스케일 바, 25 음.
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Discussion
가벼운 현미경에 빠르게 화면, 이미지, 손상 뇌 조직 내의 신경 네트워크 분석은 귀중한되어 필요를 통해 조사의 연결 집합을 대상으로 형광 단백질을 사용하는 광범위한 응용 프로그램을 감안할 때.
사용자 친화적인 생체내 electroporation 기법에 바이러스성 벡터, 그리고 유전자 변형 마우스 종자의 개발에 기술적인 진보는 이제 조사를 표시 셀 종류의 겉보기 무제한 소스를 제공합니다. 그러나, 손상 뇌 조직의 이미지 분석은 아직 실험에 병목 현상 남아 있습니다. 방법은 여기에 설명된 형광 기자를 표현하는 뇌 조직의 일상적인 분석을 위해 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 그것은 크게, 뇌 섹션에서 조직을 준비하고 분석하는 데 필요한 시간을 잘라 저전력 및 고해상도 형광 이미징 모두와 호환됩니다 immunocytochemistry와 함께 사용할 수있는 다른 실험 동물 모델에 번역하고, 중요한 것은, 널리입니다 multiphoton 이미징 장비에 대한 액세스 권한이 없을 수 있습니다 일상적인 실험실 환경에 적용. 그러나주의하는 것이 중요합니다, 글리세롤 및 기타 수성 유기 솔루션과 그 광학 삭제는 실질적인 제한 사항이 있습니다. 여기 우리는 두께가 200 음 뇌 조각의 삭제를 돕기 위해 글리세롤의 사용을 설명합니다. 이 방법은 최대 200 음 조직의 영상 해상도를 개선하기 위해 매우 잘 작동하지만, 우리는이 이상의 개선을 볼 수 없습니다. 기타 유기 용제 추가 조직을 삭제 할 수 있으며, 그러나 무역 형광 신호의 손실 (또는 추출)와 항상 존재 꺼져 있습니다.
위에서 설명한 방법 중 가능한 유사 FP 형광, 깔끔히 자동화 및 시리얼 이미징과 호환되는 다른 수성 또는 유기 상 용매와 삭제, 또는 두꺼운 뇌 조각의 이미징을 허용 다중 광자 micropscopy 함께 페어링, perstaltic 펌프를 사용하여 재관류를 포함할 수 있습니다 .
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Disclosures
지앤 - 창족 콩이 문서에서 사용되는 제품을 제조 Precisionary 인 스트 루먼트 주식 회사의 직원입니다.
Acknowledgments
이 작품은 맥네어 재단, NARSAD, 그리고 NINDS 부여 R00NS064171 - 03을 통해 지원이 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR international | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | -or equivalent |
References
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