Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Summary

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Abstract

Een fundamentele doel om zowel fundamenteel en klinisch neurowetenschap is een beter begrip van de identiteit, moleculaire make-up, en patronen van connectiviteit die kenmerkend zijn voor neuronen in zowel de normale en zieke hersenen. Naar deze, heeft een grote inspanning is geplaatst op het bouwen van hoge-resolutie neuroanatomische maps ^1-3. Met de uitbreiding van de moleculaire genetica en de vooruitgang in het licht microscopie is gekomen de mogelijkheid om niet alleen de neuronale morfologie query, maar ook de moleculaire en cellulaire samenstelling van individuele neuronen en hun bijbehorende netwerken ^4. Belangrijke vooruitgang in het vermogen om te markeren en neuronen te manipuleren door middel van transgene en gentargeting technologieën in de knaagdieren nu toe dat de onderzoekers tot neuronale 'programma' subsets naar believen ^5-6. Ongetwijfeld, is een van de meest invloedrijke bijdragen aan de hedendaagse neurowetenschappen is de ontdekking en het klonen van genen die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP's) in ongewervelde zeedieren ^7-8, naast hun latere engineering een steeds groeiende toolbox van vitaal verslaggevers ⁹ opleveren. Het benutten van celtype-specifieke promotor activiteit gerichte FP uitdrukking rijden in discrete neuronale populaties biedt nu neuroanatomische onderzoek met genetische precisie.

Techniek FP expressie in neuronen is enorm verbeterd ons begrip van de hersenen structuur en functie. Echter, imaging individuele neuronen en de bijbehorende netwerken in diepe hersenstimulatie weefsels, of in drie dimensies, bleef een uitdaging. Vanwege de hoge vetgehalte, zenuwweefsel is nogal ondoorzichtig en vertoont auto fluorescentie. Deze inherente biofysische eigenschappen maken het moeilijk om te visualiseren en het imago fluorescent gelabelde neuronen met een hoge resolutie met behulp van standaard epifluorescerende of confocale microscopie verder dan een diepte van tientallen micron. Te ontwijken deze uitdaging aan onderzoekers vaak gebruik serial thin-sectie imaging methoden en wederopbouw ^10, of twee-foton laser scanning microscopie ^11. De huidige nadelen aan deze benaderingen zijn de bijbehorende arbeidsintensieve weefsel preparaat, of kosten prohibitief instrumentatie respectievelijk.

Hier presenteren wij een relatief snelle en eenvoudige methode om fluorescent gelabelde cellen te visualiseren in vaste semi-dikke sneden de hersenen van muizen met optische clearing-en beeldvorming. In de bijgevoegde protocol beschrijven we de methoden van: 1) de vaststelling van hersenweefsel in situ via intracardiale perfusie, 2) dissectie en verwijdering van hele hersenen, 3) stationaire hersenen inbedding in agarose, 4) precisie semi-dikke plak voorbereiding met behulp van nieuwe instrumenten vibratome , 5) clearing hersenweefsel door middel van een glycerol gradiënt, en 6) montage op glazen dia's voor lichtmicroscopie en de z-stack reconstructie (figuur 1).

Ter voorbereiding van de hersenen plakjes we een relatief nieuw stuk van de instrumentatie de 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Dit instrument is een semi-automatische microtoom uitgerust met een gemotoriseerde vooraf en blade-vibratie systeem met soortgelijke kenmerken in functie van andere vibratomes. In tegenstelling tot andere vibratomes, is het weefsel te worden gesneden gemonteerd in een agarose plug in een roestvrij stalen cilinder. Het weefsel wordt geëxtrudeerd bij de gewenste dikte van de cilinder, en snijd de forward oprukkende vibrerende mes. De agarose plug / cilinder-systeem zorgt voor reproduceerbare weefsel montage, uitlijning en precisie snijden. In onze handen, de 'Compresstome' levert een hoge kwaliteit tissue slices voor de elektrofysiologie, immunohistochemie, en directe vaste weefsel montage en beeldvorming. In combinatie met optische clearing, hier tonen we de voorbereiding van de semi-dikke vaste hersencoupes voor hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming.

Protocol

1. In situ hersenen fixatie

* Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
* Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Reserveer een extra 5-10 ml van de PFA / PBS voor post fixatie.

1. Injecteer experimentele muis intraperitoneaal met een dodelijke dosis van Avertin of Nembutal.
2. Zodra de muis wordt verdoofd, nat van de buik met ethanol en veilig met de muis naar de onderkant van een blad gelaagd met kurk, was, of siliconen elastomeer met dissectie pinnen. Met de buik naar boven, zet de vier poten naar het oppervlak - het verspreiden van deze zo breed mogelijk.
3. Pak de huid met een tang op het niveau van het borstbeen, en snijd dwars op de lever bloot te leggen. Up gesneden zijwaarts en vervolgens door de ribben en het middenrif. Verwijder de rib weefsel klep en verder te snijden tot het hart toegankelijk is.
4. Doorboren of knip het recht atrium om verspreid bloed af te voeren.
5. Spoelen resterende bloed uit de bloedsomloop door perfusie van PBS door linker hartkamer.
6. Toegang tot de dezelfde naald gat, fix hele muis door latere perfusie van PBS / PFA door middel van de linker hartkamer.

2. Dissection en hersenen extractie

1. Verwijder het vel van hoofd, nek en schedel door te snijden om de gehoorgang en ogen banen, gevolgd door te trekken de huid naar voren om de schedel bloot te leggen.
   * Zie figuur 2 voor een illustratie van de stappen 2.2) tot 2.5)
2. Met behulp van een bot schaar, snijden dwars door het oog van de aansluiting via de nasale turbinate botten. Doe dit voor elke kant. De kopse moet juist voor de ogen en de olfactorische bollen.
3. Snijd de lengte van elke gehoorgang oogkas.
4. Met behulp van een klein dissectie schaar, knip het schedelbeen plaat bovenliggende het cerebellum van het ene oor naar het andere.
5. Met dezelfde dissectie schaar, knippen voorzijde over de middellijn tot het niveau van de olfactorische bollen.
6. Met behulp van een tang, verwijdert u elk bot plaatje van de hersenen, waarbij zorg aan een bindweefsel te verwijderen, zodat de hersenen intact blijft bij het optillen van het bot.
7. Snip optiek en hersenzenuwen, snijd de bovenste nekwervels, en verwijder de hersenen in fixeermiddel.
8. Post-fix voor 1-2 uur bij 4 ° C. Was de 3 keer 15 minuten elk in PBS.

3. Agarose inbedding

1. Smelt 2% hoge sterkte, laag-gelpunt agarose type IB (Sigma catalogusnummer: A0576) in PBS zoutoplossing met magnetron.
2. Overdracht gesmolten agarose in een reageerbuis. Plaats reageerbuisje in een warme couveuse of water bad (40 ° -41 ° C) totdat de temperatuur evenwicht.
3. Lijm vast hersenweefsel op de zuiger van het specimen spuit met cyanoacrylaat lijm (figuur 3A). Borstel een dunne laag van verzadigde sucrose-PBS-oplossing op het oppervlak van het hersenweefsel aan de latere release van de agarose ring van de hersenen plakjes te vergemakkelijken.
4. Trek de zuiger naar beneden met hersenweefsel in de zuiger behuizing (Figuur 3B).
5. Pipet of giet warm agarose in de zuiger behuizing, die het hersenweefsel. Voorkomen dat luchtbellen in de agarose. Luchtbellen in de agarose zal afbreuk doen aan de slice kwaliteit.
6. Klem het preparaat spuit met een koud (0 ° tot -25 ° C) koelen blokkeren voor een minuut aan de agarose (Figuur 3C) in te stellen.

4. Snijden hersenen slice met de Compresstome

1. Monteer het monster spuit met het hersenweefsel in de Compresstome (Figuur 3D).
2. Lijn de rand van het scheermesje nauw samen met de uitlaat van het monster spuit (figuur 3E).
3. Vul de buffertank met PBS-oplossing.
4. Naar voren Draai de micrometer een slice dikte van de agarose-hersenweefsel blok extruderen uit van het monster spuit.
5. Druk op de "start" knop op de controle-eenheid van de Compresstome aan het snijden proces te starten.
6. Herhaal de stappen 4.4) tot 4.5) totdat het gewenste schijfjes worden verkregen bij te bepalen dikte.
7. Oogst hersenen plakjes met kwast of pipet om flesjes of vlekken putten gevuld met PBS (figuur 3F).

5. Optische Clearing

1. Bereid een 75% vol: vol oplossing van glycerol: PBS.
2. Giet (of pipet) van de helft van het volume van de PBS wassen van de verzamelde hersenen plakjes.
3. Voeg achterkant van het volume verwijderd met glycerol / PBS.
4. Laat met zachte mengen evenwicht bij 4 ° C tot de plakjes gootsteen.
5. Herhaal de stappen 6.2) tot 6.4) totdat een definitieve glycerol concentratie bereikt 75%.
6. Vervang de oplossing met 90% glycerol in PBS om de temperatuur ervan.
   * Opmerking: Zorg ervoor dat u luchtbellen te introduceren tijdens het toevoegen van glycerol-oplossingen. Langzaam giet oplossingen en meng voorzichtig, want luchtbellen zal bemoeien met uniform equilibraTIE en zal worden overgedragen naar slide montage.

6. Slice montage voor beeldvorming

1. Cut dubbelzijdige afdichting lijm (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) in een open rechthoek om het zichtbare gebied van een micro-dia (Superfrost Plus, 25 passen x 75 x 1 mm, cat. # 48311-703, VWR ) met zijden 2-3 mm breed.
2. Leg de hersenen plakjes in het midden van het plakband rechthoek met behulp van een pipet of penseel. Verwijder overtollig glycerol met zachte aspiratie.
3. Schik de hersenen plakjes op dia in gewenste volgorde met een penseel.
4. Voorzichtig lagere dekking van glas (24 x 60 mm, cat. # 48383-139, VWR) op de tape, zorg ervoor dat u luchtbellen te introduceren. Voorzichtig druk uitoefenen op dekglas om contact met plakband te verzekeren.
5. Aspireren overtollige glycerol vanaf de randen tussen de glijbaan en dekglaasje.
6. Seal glijbaan en dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak.
7. Laten drogen voordat beeldvorming, of langdurig op te slaan in dozen schuiven bij 4 ° C.

7. Representatieve resultaten:

Processing, imaging, en analyseren van fluorescent gelabelde hersenweefsel zijn onmisbaar geworden voor de studie van de neurobiologie. Veel van deze onderzoeken vereisen geavanceerde genetische manipulaties aan reporter uiting in gerichte neuronale subsets, gevolgd door zowel de lage-en hoge-resolutie afbeelding analyses te verkrijgen. Vaak experimentele en technische beperkingen maken het onmogelijk om dit soort gegevens te verkrijgen van hetzelfde dier, of op een snelle manier. Voorbereiding van de optisch-gewist, semi-dikke hersenen secties voor fluorescerende beeldvorming steun in deze uitdaging. Een voorbeeld van een intacte hersenen dikke plak voorzien van een genetisch gemodificeerd virus hondsdolheid ontworpen om te uiten EGFP en beeld gebracht met behulp van epifluorescerende en confocale microscopie is weergegeven in figuur 4 en respectievelijk Figuur 5. Voor epifluorescerende imaging hebben we gebruik gemaakt van een Leica M205 FA, en voor confocale beeldacquisitie gebruikten we een Zeiss LSM 510. Door de relatieve eenvoud van de bijgevoegde protocol, is deze methode kunnen opleveren nuttige beeldgegevens van weefsel te drukken tl-verslaggevers met een doorlooptijd van minder dan een dag, en is compatibel met zowel lage-en hoge-resolutie lichtmicroscopie.

Als de onderzoeker ervoor kiest om extra postmortale etikettering methoden, immunohistochemische kleuringen, op te nemen of dunnere secties te maken, het protocol verlengt dienovereenkomstig. Echter, de hierboven beschreven methode is een eenvoudige en relatief high-throughput-methode voor de screening patronen van vitale reporter uitdrukking in intacte hersenen.

Figuur 1. Stroomdiagram diagraming de fixatie, dissectie, snijden, clearing, en monteren de procedure van semi-dikke hersenen plakken.

Figuur 2. Diagram van sequentiële snijden stappen om de intacte hersenen van muizen te halen.

Figuur 3. Stappen voor het monteren en snijd het hersenweefsel met behulp van de Compresstome. A) Plaatsing van hersenweefsel op snij-zuiger met behulp van superlijm. B) de opstelling beneden de gemonteerde hersenweefsel in de zuiger voor agarose inbedding. C) laten stollen van een agarose brein plug met behulp van een gekoeld compressie blok. D) Invoeging van agarose de hersenen plug-and-zuiger in Compresstome maaikamer. E) Aanpassing van scheermes aan de zuiger apparaat. F) snijden en het verzamelen van de hersenen in plakjes Compresstome buffer kamer.

Figuur 4. Lichtmicroscopie beelden van een dikke plak van glycerol-geklaard hersenweefsel door de frontale cortex uiten versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP). A) Coronale slice door middel van een muis hersenen (200 um dik) voorzien van een virale vector die EGFP en belicht met een lage resolutie met behulp van een stereoscoop epifluorescerende. Schaal bar, 2 mm.

Figuur 5. Hoge vergroting afbeelding van fluorescent gelabelde laag 5 / 6 corticale neuronen in de hersenen een gewist dikke plak. A) Hoge resolutie confocale afbeelding van een maximale projectie Z-stack (150 um dik) door de regio gemarkeerd (figuur 4). Schaalbalk, 25 um.

Discussion

Gezien de wijdverbreide toepassing van het gebruik van fluorescerende eiwitten aan neuronale subsets doelstelling voor onderzoek via lichtmicroscopie, de noodzaak om snel het scherm, beeld, en analyseren van neurale netwerken binnen intact hersenweefsel is geworden van onschatbare waarde.

Technische vooruitgang in de ontwikkeling van gebruiksvriendelijke virale vectoren, in vivo elektroporatie technieken, en genetisch gemodificeerde muizenstammen biedt nu een schijnbaar onuitputtelijke bron van gelabeld celtypen te onderzoeken. Echter, beeld analyse van intacte hersenweefsel blijft nog steeds een knelpunt te experimenteren. De hier beschreven methode heeft bewezen zeer waardevol voor ons routine-analyse van hersenweefsel te drukken TL-verslaggevers. Het kapt aanzienlijk de tijd die nodig is voor te bereiden en weefsel te analyseren vanuit de hersenen secties, is compatibel met zowel low-power en hoge-resolutie fluorescentie beeldvorming, kan gebruikt worden in combinatie met immunocytochemie, vertaalbaar is naar andere experimentele diermodellen, en belangrijker nog, is in grote lijnen van toepassing zijn op routine laboratorium omgevingen die niet kunnen toegang hebben tot multifoton beeldapparatuur. Het is belangrijk op te merken, dat de optische clearing met glycerol en andere waterige en organische oplossingen heeft praktische beperkingen. Hier beschrijven we het gebruik van glycerol om de clearing van de hersenen plakjes steun tot 200 um dik. Hoewel deze methode werkt heel goed om de beeldvorming resolutie in de weefsels te verbeteren tot 200 um, zien we niet een verbetering dan dit. Andere organische oplosmiddelen in staat zijn om clearing weefsel verder, maar er is altijd een afweging met het verlies (of de extractie) van fluorescent signaal.

Mogelijke variaties van de hierboven beschreven methode kunnen onder meer met behulp van perfusie perstaltic pompen-, clearing-met andere waterige of organische fase oplosmiddelen die compatibel zijn met FP fluorescentie, geautomatiseerde snijden en seriële beeldvorming, of koppeling met multi-foton micropscopy tot beeldvorming toe te staan, zelfs dikkere plakjes hersenen .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bone scissors	F.S.T.	16044-10	-or equivalent
dissection scissors	F.S.T.	14084-08	-or equivalent
type I-B agarose	Sigma-Aldrich	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-other vibratomes are compatible
double sided adhesive	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L
Superfrost Plus slides	VWR international	48311-703
Cover glass	VWR international	48383-139
glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	-or equivalent