Une approche rapide à l'imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais
Summary
Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.
Abstract
Un objectif fondamental à la fois fondamentales et cliniques en neurosciences est de mieux comprendre les identités, composition moléculaire, et des modèles de connectivité qui sont caractéristiques de neurones dans le cerveau normal et pathologique. Vers ce faire, un grand effort a été mis sur le renforcement cartes à haute résolution neuroanatomiques 1-3. Avec l'expansion de la génétique moléculaire et les avancées en microscopie optique est venu la possibilité d'interroger non seulement les morphologies neuronales, mais aussi la composition moléculaire et cellulaire des neurones individuels et leurs réseaux associés 4. Des avancées majeures dans la capacité de marquer et de manipuler des neurones et des gènes transgéniques par le biais des technologies de ciblage dans le rongeur désormais permettre aux enquêteurs de sous-ensembles neuronaux «programme» à volonté, 5-6. Sans doute, l'une des contributions les plus influents au contemporain neurosciences a été la découverte et le clonage de gènes codant pour des protéines fluorescentes (PC) chez les invertébrés marins 7-8, aux côtés de leurs ingénieurs ultérieure pour obtenir une boîte à outils sans cesse croissant de journalistes vitale 9. Exploiter une activité de promoteur spécifique du type cellulaire pour conduire l'expression ciblée de PF dans discrètes populations neuronales offre désormais enquête neuroanatomiques avec précision génétique.
Ingénierie FP expression dans les neurones a considérablement amélioré notre compréhension de la structure et la fonction cérébrales. Cependant, les neurones individuels d'imagerie et de leurs réseaux associés dans les tissus du cerveau profond, ou en trois dimensions, est restée un défi. Grâce à forte teneur en lipides, le tissu nerveux est assez opaque et autofluorescence expositions. Ces propriétés inhérentes biophysiques font qu'il est difficile de visualiser et d'image neurones marqués par fluorescence à haute résolution en utilisant la microscopie à épifluorescence standards ou confocale delà des profondeurs de plusieurs dizaines de microns. Pour contourner cette difficulté ont souvent recours à des enquêteurs de série à section mince d'imagerie et de 10 méthodes de reconstruction, ou la microscopie laser à 2 photons de numérisation 11. Inconvénients actuels de ces approches sont la préparation des tissus associés de main-d'œuvre, ou coût prohibitif d'instrumentation, respectivement.
Ici, nous présentons une méthode relativement simple et rapide de visualiser les cellules marquées par fluorescence dans les fixes semi-épais tranches de cerveau de souris en compensation optique et d'imagerie. Dans le protocole ci-joint, nous décrivons les méthodes de: 1) le tissu cérébral de fixation in situ par perfusion intracardiaque, 2) la dissection et l'enlèvement de cerveau entier, 3) intégrer le cerveau stationnaire dans l'agarose, 4) préparation de tranches de précision semi-épais à l'aide de nouveaux instruments vibratome tissus, 5) du cerveau de compensation à travers un gradient de glycérol, et 6) de fixation sur lames de verre pour la microscopie optique et z-stack de reconstruction (figure 1).
Pour la préparation de tranches de cerveau nous avons mis un morceau relativement nouveau de l'instrumentation appelé «Compresstome 'VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Cet instrument est un microtome semi-automatique équipé d'une avance motorisé et le système de vibration des aubes avec des fonctions similaires en fonction de vibratomes autres. Contrairement à d'autres vibratomes, le tissu à découper en tranches est montée dans un bouchon d'agarose dans un cylindre en acier inoxydable. Le tissu est extrudé à des épaisseurs souhaitée dans le cylindre, et coupé par la lame vers l'avant avancer vibrante. La fiche d'agarose / système de vérin permet de tissus reproductibles de montage, l'alignement et une coupe de précision. Dans nos mains, le «Compresstome« rendements élevés des tranches de tissu de qualité pour l'électrophysiologie, l'immunohistochimie et directe fixe les tissus de montage et d'imagerie. Combiné avec la compensation optique, ici nous montrent la préparation de semi-épais tranches de cerveau fixes à haute résolution pour l'imagerie de fluorescence.
Protocol
Discussion
Compte tenu de l'application généralisée de l'utilisation de protéines fluorescentes de cibler des sous-ensembles neuronaux pour enquête par l'intermédiaire microscopie optique, la nécessité de dépister rapidement, l'image, et d'analyser les réseaux de neurones dans le tissu cérébral intact est devenu une valeur inestimable.
Les progrès techniques dans le développement de convivialité vecteurs viraux, en techniques d'électroporation in viv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par un soutien à travers la Fondation McNair, NARSAD, et NINDS octroi R00NS064171-03.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. . The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, . Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
