一个快速高分辨率的荧光成像的方法在半厚的脑片
Summary
在这里，我们描述了一个快速和简单的的方法，形象荧光标记的细胞在半厚的脑片。通过固定，切片，和光清除脑组织中，我们介绍了如何标准啶或共焦成像可用于个人完整的神经组织内的细胞和神经网络的可视化。
Abstract
基础和临床神经科学的根本目标是为了更好地理解人的身份，分子结构和特点在正常和病变脑的神经元的连接模式。朝着这个，一个很大的努力一直放在建设高解析度神经解剖学地图1-3。随着分子遗传学和光镜的进步已经扩展能力查询，不仅神经元的形态，而且分子和细胞构成的单个神经元及其相关的网络4。标记和操纵通过转基因和基因打靶技术在啮齿类动物的神经元的能力的重大进展， 现在允许以5-6将“纲要”神经元亚群的调查。可以说，最有影响力的现代神经科学的贡献之一，已发现和克隆基因编码荧光蛋白（FPS）7-8，沿着他们的后续工程，在海洋无脊椎动物的产量不断扩大的一个至关重要的记者工具箱9。现在利用特定细胞类型的启动子活性的驱动器在离散的神经元群体针对性的FP表达给予神经解剖与遗传精密的调查。
工程FP神经元中表达，大大提高了我们的大脑结构和功能的认识。然而，成像的单个神经元和脑深部组织，或在三个方面及其相关的网络，仍然是一个挑战。由于脂肪含量高，神经组织，而不透明和展品自动荧光。这些固有的生物物理特性，很难想象和高分辨率的图像使用超过几十微米的深度标准啶或共聚焦显微镜荧光标记的神经元。为了规避这一挑战调查往往采用串行薄片成像和重建方法10，或双光子激光扫描显微镜11。目前这些方法的缺点是相关的劳动密集的组织准备，或成本高昂的仪器。
在这里，我们提出了一个相对快速和简单的的方法来可视化在固定半厚的小鼠大脑切片荧光标记的细胞，通过光学结算和成像。在附加协议中，我们描述的方法：1）固定在原地通过intracardial灌注，2）剥离和清除整个大脑，3）固定大脑包埋在琼脂糖，4）精密半厚片准备使用新vibratome仪器的脑组织光镜和Z – Stack的重建（ 图1），5）通过甘油梯度结算脑组织，以及6）安装在载玻片上。
准备脑切片中，我们实现了一个相对较新的仪器，称为“Compresstome”，VF – 200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）。这台仪器是一种半自动切片机，配备一个电动推进和叶片振动系统与功能，在功能类似于其他vibratomes。与其他vibratomes不同的是，要切片的组织琼脂糖插件是安装在一个不锈钢圆筒内。该组织是在想要从汽缸厚度挤压，并向前推进的振动刀片切割。琼脂糖插件/气缸系统可重复性组织安装，对齐方式和精密切割。在我们手中，“Compresstome”产量高品质的电生理，免疫组织化学组织切片，并直接固定组织安装和成像。与光学清算相结合，在这里我们展示高分辨率荧光成像的固定半厚的脑片的准备。
Protocol
Discussion
鉴于广泛的应用，使用荧光蛋白为目标，通过光镜，需要迅速屏幕上，图像和分析完整的脑组织内神经网络已成为宝贵的调查的神经元亚群。
在用户友好的病毒载体，在体内电穿孔技术，转基因小鼠品系的发展技术进步提供了一个看似无限的源标记的细胞类型进行调查。然而，完整的脑组织图像分析仍是一个实验的瓶颈。这里介绍的方法已被证明为我们日常的脑组织?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国支持通过捷基金会，NARSAD，和NINDS授予R00NS064171 – 03。
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
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