En snabb metod för högupplöst fluorescens avbildning i semi-Tjock hjärnan skivor
Summary
Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att bilden fluorescerande celler i semi-tjocka hjärnan skivor. Genom att fastställa, skivning, och optiskt clearing hjärnvävnad beskriver vi hur standarden epifluorescent eller konfokal avbildning kan användas för att visualisera enskilda celler och neuronala nätverk inom intakt nervvävnad.
Abstract
En grundläggande målsättning för både grundforskning och klinisk neurovetenskap är att bättre förstå de identiteter, molekylära makeup och mönster av anslutningsmöjligheter som är kännetecknande för nervceller i både normala och sjuka hjärna. Mot detta har ett stort arbete lagts på att bygga med hög upplösning neuroanatomiska kartorna 1-3. Med utbyggnaden av molekylärgenetik och framsteg i ljusmikroskop har kommit förmågan att frågan inte bara neuronala morfologier, men även molekylära och cellulära makeup av enskilda nervceller och tillhörande nätverk 4. Stora framsteg i förmågan att markera och manipulera nervceller genom transgena och riktad genmodifiering tekniker inom gnagare tillåter nu utredare för att "program" neuronala delmängder efter behag 5-6. Förmodligen har en av de mest inflytelserika bidragen till dagens neurovetenskap blivit upptäckt och kloning av gener som kodar för fluorescerande proteiner (FPS) i marina ryggradslösa 7-8, tillsammans med deras senare konstruktion för att ge en ständigt växande verktygslåda av vitala reportrar 9. Utnyttja celltyp-specifika promotorn verksamhet för att driva riktad FP uttryck i diskret neuronala populationer ger nu neuroanatomiska undersökning med genetisk precision.
Engineering FP uttryck i nervceller har kraftigt förbättrat vår förståelse av hjärnans struktur och funktion. Men avbildning enskilda nervceller och tillhörande nätverk i deep brain vävnader eller i tre dimensioner, har förblivit en utmaning. På grund av hög fetthalten är nervvävnad ganska ogenomskinligt och utställningar auto fluorescens. Dessa inneboende biofysiska egenskaper gör det svårt att visualisera och bild fluorescerande nervceller med hög upplösning med standard epifluorescent eller konfokalmikroskopi bortom djupet av tiotals mikrometer. För att kringgå denna utmaning utredare ofta använder seriell tunna avsnitt bildbehandling och metoder rekonstruktion 10, eller 2-foton laserskanning mikroskopi 11. Aktuell nackdelar med dessa metoder är förknippade arbetsintensiva vävnad beredningen eller kostsamt instrumentering respektive.
Här presenterar vi en relativt snabb och enkel metod för att visualisera fluorescerande celler i fasta semi-tjocka skivor musen hjärnan genom optisk clearing och bildbehandling. I det bifogade protokollet beskriver vi de metoder: 1) fastställande hjärnvävnad på plats via intrakadriell perfusion, 2) dissekering och borttagning av hela hjärnan, 3) stationär hjärnan ingjutning i agaros, 4) precision semi-tjock skiva förberedelser med nya vibratome instrumentering , 5) clearing hjärnvävnaden via en glycerol lutning, och 6) montering på objektglas för ljusmikroskopi och z-stack rekonstruktion (Figur 1).
För att förbereda hjärnan skivor vi genomfört en relativt ny bit av instrument som kallas "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Detta instrument är en semi-automatiserad mikrotom försedd med en motoriserad förväg och blad vibrationer systemet med funktioner liknande funktion till andra vibratomes. Till skillnad från andra vibratomes är den vävnad som ska skivas monteras i en agaros kontakt inom en rostfri cylinder. Vävnaden är pressad till önskad tjocklek från cylindern, och skär av den framåt framåt vibrerande blad. Den agarosen tändstift / cylinder system möjliggör reproducerbara vävnad montering, justering och precisionskapning. I våra händer, den "Compresstome" ger hög kvalitet vävnad skivor för elektrofysiologi, immunohistokemi, och direkt fast vävnad montering och bildbehandling. Kombinerat med optisk clearing, här vi visar att förbereda semi-tjocka fast hjärnan skivor för högupplöst fluorescerande avbildning.
Protocol
Discussion
Med tanke på den utbredda tillämpningen av med fluorescerande proteiner för att rikta neuronala undergrupper för utredning via ljusmikroskop, behovet av att snabbt skärm, bild och analysera neurala nätverk inom intakt hjärnvävnad har blivit ovärderlig.
Tekniska framsteg i utvecklingen av användarvänliga virala vektorer, in vivo elektroporering tekniker, och genetiskt modifierade stammar mus ger nu en till synes obegränsad källa av märkt celltyper att undersöka. Dock f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av stöd genom McNair Foundation, NARSAD och NINDS bevilja R00NS064171-03.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. . The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, . Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
