Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En snabb metod för högupplöst fluorescens avbildning i semi-Tjock hjärnan skivor

doi: 10.3791/2807 Published: July 26, 2011

Summary

Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att bilden fluorescerande celler i semi-tjocka hjärnan skivor. Genom att fastställa, skivning, och optiskt clearing hjärnvävnad beskriver vi hur standarden epifluorescent eller konfokal avbildning kan användas för att visualisera enskilda celler och neuronala nätverk inom intakt nervvävnad.

Abstract

En grundläggande målsättning för både grundforskning och klinisk neurovetenskap är att bättre förstå de identiteter, molekylära makeup och mönster av anslutningsmöjligheter som är kännetecknande för nervceller i både normala och sjuka hjärna. Mot detta har ett stort arbete lagts på att bygga med hög upplösning neuroanatomiska kartorna 1-3. Med utbyggnaden av molekylärgenetik och framsteg i ljusmikroskop har kommit förmågan att frågan inte bara neuronala morfologier, men även molekylära och cellulära makeup av enskilda nervceller och tillhörande nätverk 4. Stora framsteg i förmågan att markera och manipulera nervceller genom transgena och riktad genmodifiering tekniker inom gnagare tillåter nu utredare för att "program" neuronala delmängder efter behag 5-6. Förmodligen har en av de mest inflytelserika bidragen till dagens neurovetenskap blivit upptäckt och kloning av gener som kodar för fluorescerande proteiner (FPS) i marina ryggradslösa 7-8, tillsammans med deras senare konstruktion för att ge en ständigt växande verktygslåda av vitala reportrar 9. Utnyttja celltyp-specifika promotorn verksamhet för att driva riktad FP uttryck i diskret neuronala populationer ger nu neuroanatomiska undersökning med genetisk precision.

Engineering FP uttryck i nervceller har kraftigt förbättrat vår förståelse av hjärnans struktur och funktion. Men avbildning enskilda nervceller och tillhörande nätverk i deep brain vävnader eller i tre dimensioner, har förblivit en utmaning. På grund av hög fetthalten är nervvävnad ganska ogenomskinligt och utställningar auto fluorescens. Dessa inneboende biofysiska egenskaper gör det svårt att visualisera och bild fluorescerande nervceller med hög upplösning med standard epifluorescent eller konfokalmikroskopi bortom djupet av tiotals mikrometer. För att kringgå denna utmaning utredare ofta använder seriell tunna avsnitt bildbehandling och metoder rekonstruktion 10, eller 2-foton laserskanning mikroskopi 11. Aktuell nackdelar med dessa metoder är förknippade arbetsintensiva vävnad beredningen eller kostsamt instrumentering respektive.

Här presenterar vi en relativt snabb och enkel metod för att visualisera fluorescerande celler i fasta semi-tjocka skivor musen hjärnan genom optisk clearing och bildbehandling. I det bifogade protokollet beskriver vi de metoder: 1) fastställande hjärnvävnad på plats via intrakadriell perfusion, 2) dissekering och borttagning av hela hjärnan, 3) stationär hjärnan ingjutning i agaros, 4) precision semi-tjock skiva förberedelser med nya vibratome instrumentering , 5) clearing hjärnvävnaden via en glycerol lutning, och 6) montering på objektglas för ljusmikroskopi och z-stack rekonstruktion (Figur 1).

För att förbereda hjärnan skivor vi genomfört en relativt ny bit av instrument som kallas "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Detta instrument är en semi-automatiserad mikrotom försedd med en motoriserad förväg och blad vibrationer systemet med funktioner liknande funktion till andra vibratomes. Till skillnad från andra vibratomes är den vävnad som ska skivas monteras i en agaros kontakt inom en rostfri cylinder. Vävnaden är pressad till önskad tjocklek från cylindern, och skär av den framåt framåt vibrerande blad. Den agarosen tändstift / cylinder system möjliggör reproducerbara vävnad montering, justering och precisionskapning. I våra händer, den "Compresstome" ger hög kvalitet vävnad skivor för elektrofysiologi, immunohistokemi, och direkt fast vävnad montering och bildbehandling. Kombinerat med optisk clearing, här vi visar att förbereda semi-tjocka fast hjärnan skivor för högupplöst fluorescerande avbildning.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. In situ hjärnan fixering

* Förbered en 10 ml spruta (28 gauge) fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
* Förbered en 10 ml spruta (28 gauge) fylld med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Boka en ytterligare 5-10 ml PFA / PBS för post fixering.

  1. Injicera experimentell mus intraperitonealt med en dödlig dos av Avertin eller nembutal.
  2. När musen är sövd, våt buken med etanol och säkra musen till botten av en bricka lager med kork, vax eller silikon elastomer med dissektion stift. Med buken uppåt, säkra de fyra tassar till ytan - att sprida ut dem så bred som möjligt.
  3. Ta tag i huden med pincett i nivå med bröstbenet, och skär på tvären för att exponera levern. Skär i sidled och sedan upp genom revben och membranet. Ta bort luckan revben vävnaden och fortsätter skära tills hjärtat är tillgänglig.
  4. Punkteras eller klipp höger förmak för att tömma ut blod.
  5. Spola rester av blod från cirkulationssystemet genom perfusion av PBS via vänster kammare.
  6. Komma åt samma nål hål, fixa hela musen genom senare perfusion av PBS / PFA via vänster kammare.

2. Dissektion och hjärnan utvinning

  1. Ta bort skinnet från huvudet, halsen och kraniet genom att skära runt hörselgången och banor öga, följt av att dra huden anteriorly att exponera kraniet.
    * Se figur 2 för en illustration av stegen 2,2) till 2,5)
  2. Använda ett ben saxar, skär på tvären från ögonen uttaget genom näsan turbinata ben. Gör detta för varje sida. Den crosscut bör anterior för ögon och lukt lökar.
  3. Skär längden från varje hörselgången ögonhålan.
  4. Använd en liten dissektion sax, klipp Nackknölen plattan överliggande lillhjärnan från en hörselgången till den andra.
  5. Med samma dissektion sax, klippa anteriorly längs mittlinjen för att nivån på luktsinnet glödlampor.
  6. Använd pincett, ta bort varje ben plattan från hjärnan, var noga med att ta bort alla bindväv så att hjärnan är intakt när du lyfter upp benet.
  7. Snip optik och kranialnerver, skär den översta halskotorna och ta bort hjärnan i fixativ.
  8. Post-fix för 1-2 timmar vid 4 ° C. Tvätta 3 gånger 15 minuter vardera i PBS.

3. Agarosen inbäddning

  1. Smält 2% med hög styrka, låg-gel punkt agarose typ IB (Sigma katalognummer: A0576) i PBS saltlösning med mikrovågsugn.
  2. Överföring smälta agarosen till ett provrör. Placera provröret i ett varmt inkubator eller vattenbad (40 ° -41 ° C) tills temperaturen jämvikt.
  3. Limma fast hjärnvävnad på kolven av provet sprutan med cyanoakrylat lim (Figur 3A). Pensla ett tunt lager av mättade sackaros-PBS lösning på ytan av hjärnvävnaden att underlätta senare versionen av agarosen ringen från hjärnan skivor.
  4. Dra ner kolven med hjärnvävnad i kolven huset (Figur 3B).
  5. Pipett eller häll varmt agaros i kolven bostäder, som täcker hjärnvävnaden. Undvik att droppa luftbubblor i agaros. Luftbubblor i agarosen kommer att kompromissa segmentet kvalitet.
  6. Preparatet spruta med en kall (0 ° till -25 ° C) kylning blocket i 1 minut för att ställa in agaros (figur 3C).

4. Sektionering hjärnan skiva med Compresstome

  1. Montera provet sprutan innehållande hjärnvävnad i Compresstome (Figur 3D).
  2. Passa på kanten av rakblad nära utloppet av provet sprutan (Figur 3E).
  3. Fyll bufferttank med PBS-lösning.
  4. Rotera mikrometer en skiva tjocklek fram emot att pressa igenom agaros-hjärnvävnaden blockera ut av provet sprutan.
  5. Tryck på "Start"-knappen på styrenheten för Compresstome att inleda snittning processen.
  6. Upprepa steg 4,4) till 4,5) tills önskad skivor erhålls vid bestämmer tjockleken.
  7. Harvest hjärnan skivor med pensel eller pipett till rör eller brunnar färgning fylld med PBS (Figur 3F).

5. Optisk Clearing

  1. Förbered en 75% vol: vol lösning av glycerol: PBS.
  2. Häll (eller pipett) från halva volymen av PBS tvätt från de insamlade hjärnan skivor.
  3. Lägg tillbaka den volym bort med glycerol / PBS.
  4. Låt jämvikt med varsam blandning vid 4 ° C tills skivorna diskhon.
  5. Upprepa steg 6,2) till 6,4) tills en slutlig glycerol koncentrationen når 75%.
  6. Byt lösning med 90% glycerol i PBS och låt jämvikt.
    * Obs: Var noga med att inte införa luftbubblor samtidigt lägga glycerol lösningar. Häll lösningar långsamt och blanda försiktigt, eftersom luftbubblor stör enhetlig equilibraning och kommer att föras över till bilden montering.

6. Skiva montering för avbildning

  1. Klipp dubbel-sidig tätning lim (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) i en öppen rektangel för att passa den synliga delen av en mikro-bild (SuperFrost Plus, 25 x 75 x 1 mm, kat. # 48.311-703, VWR ) med sidor 2-3 mm bred.
  2. Placera hjärnan skivor inne i centrum av tejp rektangel med en pipett eller pensel. Ta bort överflödig glycerol med försiktig uppsugning.
  3. Ordna hjärnan skivor på bild i önskad ordning med en pensel.
  4. Lägg försiktigt ner skyddsglas (24 x 60 mm, kat. # 48.383-139, VWR) på tejp, se till att inte införa luftbubblor. Tryck försiktigt på locket glas för att säkerställa kontakt med tejp.
  5. Aspirera överskott glycerol från kanterna mellan bild och coverglass.
  6. Seal slide och täckglas med genomskinligt nagellack.
  7. Låt torka innan avbildning, eller lagra långsiktig bild lådor vid 4 ° C.

7. Representativa resultat:

Bearbetning, imaging och analysera fluorescerande hjärnvävnad har blivit en nödvändighet att studera neurobiologi. Många av dessa utredningar kräver sofistikerade genetiska manipulationer för att få reporter uttryck i riktade neuronala undergrupper, följt av både låg-och högupplöst bild analyser. Ofta experimentella och tekniska begränsningar gör det omöjligt att få dessa typer av data från samma djur, eller på ett snabbt sätt. Beredning av optiskt-rensas, semi-tjock hjärnan sektioner för fluorescerande avbildning stöd i denna utmaning. Ett exempel på ett intakt tjock hjärna skiva märkt med en genetiskt modifierad rabiesvirus konstruerad för att uttrycka EGFP, och avbildas med epifluorescent och konfokalmikroskopi visas i Figur 4 och Figur 5. För epifluorescent avbildning vi använt en Leica M205 FA, och för konfokal bild förvärv vi använt en Zeiss LSM 510. På grund av den relativa enkelheten i det bifogade protokollet, är denna metod som kan ge användbara bilddata från vävnad uttrycka fluorescerande reportrar med en handläggningstid på mindre än en dag, och är kompatibel med både låg-och högupplösta ljusmikroskop.

Om utredaren väljer att införliva ytterligare metoder döden märkning, immunhistokemisk färgning eller göra tunnare, förlänger protokollet därefter. Dock är den metod som beskrivs ovan en enkel och relativt hög genomströmning metod för screening mönster av avgörande reporter uttryck i intakta hjärnan.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema diagraming att fixeringen, dissektion, skivning, clearing och montaget av semi-tjocka hjärnan skivor.

Figur 2
Figur 2. Diagram av sekventiell skära steg för att extrahera intakt musen hjärnan.

Figur 3
Figur 3. Steg för att montera och skiva hjärnvävnaden med Compresstome. A) Placering av hjärnvävnad på skär kolv med superlim. B) Dra ner monteras hjärnvävnaden i kolven för agarosen inbäddning. C) Konsolidera en agaros hjärna kontakt med en kyld komprimering block. D) Införande av agaros hjärnan plugg och kolven i Compresstome klippkammare. E) Anpassning av rakblad till kolven enhet. F) Kapning och insamling av hjärnan skivor i Compresstome buffert kammare.

Figur 4
Figur 4. Ljusmikroskopi bilder av en tjock skiva av glycerol rensas-hjärnvävnaden via frontala cortex uttrycka förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP). A) koronalt skära igenom en mus hjärna (200 um tjock) märkta med en viral vektor som uttrycker EGFP och avbildade med låg upplösning med hjälp av en epifluorescent stereoskop. Skala bar, 2 mm.

Figur 5
Figur 5. Hög förstoring bild av fluorescerande skikt 5 / 6 kortikala neuron i ett rensat tjock hjärna skiva. A) Högupplöst konfokala bild av en maximal projektion Z-stack (150 um tjock) genom regionen lyfts fram i (Figur 4). Skala Bar, 25 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med tanke på den utbredda tillämpningen av med fluorescerande proteiner för att rikta neuronala undergrupper för utredning via ljusmikroskop, behovet av att snabbt skärm, bild och analysera neurala nätverk inom intakt hjärnvävnad har blivit ovärderlig.

Tekniska framsteg i utvecklingen av användarvänliga virala vektorer, in vivo elektroporering tekniker, och genetiskt modifierade stammar mus ger nu en till synes obegränsad källa av märkt celltyper att undersöka. Dock fortfarande bildanalys av intakt hjärnvävnaden fortfarande en flaskhals för experiment. Den här beskrivna metoden har visat sig vara oerhört värdefullt för vår rutinanalys av hjärnvävnad uttrycka fluorescerande reportrar. Det kortar väsentligt den tid som behövs för att förbereda och analysera vävnad från hjärnan sektioner, är kompatibel med både låg effekt och hög upplösning fluorescens avbildning, kan användas i kombination med immuncytokemi, är att överföra till andra experimentella djurmodeller, och viktigare, är i stort sett tillämpas vid rutinmässig laboratorium miljöer som kanske inte har tillgång till multiphoton utrustning för bildåtergivning. Det är viktigt att notera dock att optiska clearing med glycerol och andra vattenfasen och den organiska lösningar praktiska begränsningar. Här beskriver vi använda glycerol för att underlätta rensning av hjärnan skivor upp till 200 um tjock. Även om denna metod fungerar ganska bra för att förbättra avbildning upplösning i vävnad upp till 200 um, ser vi inte en förbättring utöver detta. Andra organiska lösningsmedel kan rensa vävnad ytterligare, men det finns alltid en avvägning med förlusten (eller extraktion) av fluorescerande signal.

Möjliga variationer av den metod som beskrivs ovan kan omfatta perfusion med perstaltic pumpar, clearing med andra vatten eller organiska fasen lösningsmedel som är kompatibla med FP fluorescens, automatiserad skivning och seriell avbildning, eller para ihop med flera foton micropscopy att tillåta avbildning i ännu tjockare hjärnan skivor .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jian-Qiang Kong är anställd Precisionary Instruments, Inc., som tillverkar en produkt som används i denna artikel.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av stöd genom McNair Foundation, NARSAD och NINDS bevilja R00NS064171-03.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bone scissors F.S.T. 16044-10 -or equivalent
dissection scissors F.S.T. 14084-08 -or equivalent
type I-B agarose Sigma-Aldrich A0576
Compresstome Precisionary Instruments VF-200 -other vibratomes are compatible
double sided adhesive Grace Bio-Lab Inc. SA-S-1L
Superfrost Plus slides VWR international 48311-703
Cover glass VWR international 48383-139
glycerol EMD Millipore GX0185-6 -or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. (2009).
  2. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  3. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  4. Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  5. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
  6. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  7. Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  10. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selever, J., Kong, J., Arenkiel, B. R. A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices. J. Vis. Exp. (53), e2807, doi:10.3791/2807 (2011).More

Selever, J., Kong, J., Arenkiel, B. R. A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices. J. Vis. Exp. (53), e2807, doi:10.3791/2807 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter