Summary
نقدم نهجا جديدا لقياس توطين جسيمات متناهية الصغر في الأوعية الدموية للأورام xenografted الإنسان باستخدام الحيوية ، في الوقت الحقيقي التصوير intravital في نموذج جنين الطيور.
Abstract
التكنولوجيات الحالية للتصوير الورم ، مثل الموجات فوق الصوتية والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والتصوير المقطعي PET ، غير قادر على العائد صور عالية الدقة لتقييم امتصاص جزيئات النانو في الأورام على المستوى المجهري 1،2،3 ، تسليط الضوء على فائدة نموذج مناسب طعم أجنبي فيه لإجراء تحليلات مفصلة امتصاص. هنا ، ونحن نستخدم عالية الدقة intravital التصوير لتقييم امتصاص جزيئات النانو في xenografts الإنسان في الورم ، تعديل نموذج جنين قذيفة أقل الدجاج. وبخاصة نموذج جنين الدجاج مناسبة تماما لهذه التحليلات في الجسم الحي لأنها تدعم نمو الأورام الإنسان ، وغير مكلفة نسبيا ولا تحتاج إلى تخدير أو عملية جراحية 4،5. شكل خلايا الورم بشكل كامل xenografts أوعية دموية في غضون 7 أيام عندما زرعت في غشاء مشيمائي (CAM) 6. الأورام الناتجة تصور من غير الغازية التصوير في الوقت الحقيقي ، وارتفاع القرار الذي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 72 ساعة مع تأثير ضئيل على استضافة أو نظم الورم. النانوية مع طائفة واسعة من الأحجام والتركيبات تديرها البعيدة للورم يمكن تصور وكميا لأنها تتدفق من خلال مجرى الدم ، ويتسرب من الأوعية الدموية ورم راشح ، وتتراكم في موقع الورم. نحن هنا وصف تحليل النانوية المستمدة من فيروس تبرقش اللوبيا (CPMV) مزينة الأشعة تحت الحمراء القريبة الأصباغ الفلورية و / أو بوليمرات البولي ايثيلين جلايكول (PEG) 7 ، 8 ، 9،10،11. على الادارة في الوريد ، وهذه الجسيمات النانوية المنضوية بسرعة الفيروسية من الخلايا البطانية ، مما أدى إلى وضع العلامات العالمية في الأوعية الدموية سواء خارج وداخل 7،12 الورم. PEGylation من زيادات جزيئات فيروسية البلازما الخاصة بهم نصف الحياة ، ويمتد وقتهم في الدورة الدموية ، ويعزز في نهاية المطاف تراكمها في الأورام عن طريق تحسين نفاذية والاستبقاء (EPR) تأثير 7 ، 10،11. يتم قياس معدل ومدى تراكم النانوية في الورم على مر الزمن باستخدام برمجيات تحليل الصور. هذا الأسلوب يوفر طريقة لقياس كل من تصور وديناميات جسيمات متناهية الصغر في الأورام الإنسان.
Protocol
1. التلقيح من ورم في جنين CAM الطيور
- إعداد قذيفة أقل الأجنة المخصبة الدجاج كما هو موضح 8.
- في يوم 9 من التطور الجنيني ، تجميع الدقيقة محقن باستخدام إبرة عيار 18 متصلة على حقنة 1 مل. قطع قطعة من أنبوب 06/05 بوصة Tygon (1 / 32 "القطر الداخلي ، 3 / 32" القطر الخارجي ، 1 / 32 سمك الجدار ") وإدراج بعناية شطبة من الإبرة في الأنابيب. 4-5 بوصات تقريبا وينبغي للأنابيب تمتد من رأس الإبرة (الشكل 1A).
- حقنة ملء وقصبات مع التعليق الخلية. ثم ادخال ابرة microinjection الزجاج في نهاية الأنبوب وإزالة بعناية أي فقاعات هواء.
- ضخ يوم 9 الأجنة (1B الشكل) ضمن نطاق تشريح مع منار مع الخلايا السرطانية 10،000-100،000 باعتباره البلعة داخل CAM (الشكل 1C). حقن الخلايا ببطء والتأكد بدقة من أن الإبرة في المكان الصحيح للخلايا لتشكيل بلعة مرئية داخل CAM. الخلايا التي يمكن تنظيفها بالتنقيط على سطح CAM باستخدام قضيب Kimwipe أو غيرها.
- عودة إلى الأجنة في الحاضنة ترطيب 38 درجة مئوية في الرطوبة 60 ٪ والسماح للنمو الورم ويوعي (تصل إلى 7 أيام).
2. إعداد النانوية
- لإعداد fluorescently المسمى النانوية CPMV للحقن في جنين الدجاج ؛ تمييع النانوية الفيروسية (كما هو الحال في توليفها 8 في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 ، لتركيز خليط دوامة 100 ميكروغرام / مل جيدا قبل استخدام وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي. قد الركام. صوتنة يكون من المفيد أيضا تبعا لدرجة تقارن والتجميع. مخزون CPMVs fluorescently المسمى مستقرة على الأقل 1 سنة عند تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام. التحقق من المخزونات بصورة دورية عن طريق وضع بضع قطرات على شريحة زجاجية و التحقق من ومضان ، ويمكن أيضا نقل المجهر الإلكتروني (TEM) يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت الجزيئات بقيت سالمة بعد الاقتران.
- باختصار ، يمكن أن أضيف ميكروجرام النانوية الفيروسية (في الحجم النهائي من 2 ميكرولتر) لشبكات النحاس المطلي. المقبل ، إضافة حجم مساو من خلات اليورانيل 2 ٪ لمدة 1 دقيقة في المجهر الالكتروني (فيليبس EM 410).
3. الحقن في الوريد من جزيئات فيروسية fluorescently المسمى
- في يوم 16 ، التجمع الجزئي حاقن على النحو المبين أعلاه. التعادل رفع مستوى الصوت المطلوب من جسيمات متناهية الصغر الفيروسية من خلال أنابيب إلى حقنة (> 200 ميكرولتر). إزالة بعناية أي فقاعات هواء. ادخال ابرة microinjection الزجاج في نهاية الأنبوب. تأكد من أن الإبرة طالما ومدبب ممكن (الشكل 2A). إذا كانت الإبرة حادة جدا ، وانها لن تكون قادرة على اختراق من خلال الأديم الظاهر ، وسوف تفشل في اختراق السفينة. إذا كانت إبرة حادة جدا ، وسوف تنهار عندما غيض اختراق الأنسجة.
- حقن في الوريد 100 ميكرولتر من 1 ديكستران فلوريسئين ملغ / مل (70000 ميجاوات دا Invitrogen) في جنين تحمل ورم القاصية من موقع المراد تصور الشكل (3D). إقناء ؛ إدخال القنية الناجح الوريد كام هو واضح من قبل تطهير الدم في مسار تدفق الحقن (2B الشكل). تقييم تسرب الأوعية الدموية 1 بعد ساعة من الحقن.
- حقن في الوريد 50 ميكروليتر من 1 ملغ / مل من حل CPMV اليكسا فلور - 647 (CPMV AF - 647) أو PEGylated CPMV اليكسا فلور - 647 (CPMV - PEG - AF 647) في أجنة تحتوي على الأورام مع تسرب الأوعية الدموية الطرفية من الموقع المطلوب ل يمكن تصور.
- الصورة فورا ، والأورام في كل ساعة بعد الحقن باستخدام ممتحن زايس Z1 المجهر تستقيم مزودة قرص الغزل يوكوجاوا ، هاماماتسو ImagEM 9100-12 EM - CCD الكاميرا.
4. في الوقت الحقيقي التصوير intravital
- لتجميع وحدة تصوير الجنين ، وتطبيق طبقة رقيقة من الشحوم فراغ حول محيط الميناء التصوير على الجانب السفلي من غطاء الجنين وحدة التصوير ، ويصلح ان للزجاج 18 مم ساترة على الميناء.
- موقف مثل هذا الجنين أن ساترة ستغطي المنطقة المرغوبة للتصوير. انخفاض الغطاء ببطء حتى ساترة يجعل من مجرد اتصال مع الجنين ، ومن ثم برغي الغطاء على وحدة ليثبت في مكانه (الشكل 2C).
- إضافة الماء الساخن إلى 37 درجة مئوية في جنين وحدة التصوير الخارجي للصحن يحتوي على الجنين ، والمكان ثم الوحدة بالكامل إلى مرحلة المجهر an مبائر تستقيم مع الغرفة البيئية داخل معايرتها إلى 37 درجة مئوية.
- موقف وحدة التصوير التي تحتوي على الجنين تحت المجهر مضان مبائر غزل القرص (2E الشكل). وسوف تعقد وحدة تصوير الجنين في المكان والحفاظ على مجال الرؤية الثابتة أثناء التقاط الصور ، مما يسمح لكلا كدسات Z ثلاثي الأبعاد والصور الوقت الفاصل بين أن يكون على قبض. علينا اكتساب وتحليل ثلاثي الأبعاد الوقت الفاصل بين الصور باستخدام بيركن إلمر ل(سابقا الارتجال) Volocity حزمة برامج (الشكل 3A). يكتسب القرار عالية ثلاثية الأبعاد كومة من الورم والأوعية الدموية المحيطة بها لتصور detaileد التحليلات الهيكلية في نقاط محددة زمنيا. الحصول على ثلاث نقاط في مداخن الأبعاد الزمنية العادية لرسم خريطة تفصيلية التغييرات الهيكلية في الأوعية الدموية للورم. الأورام صورة كل ساعة بعد الحقن.
- Quantitate امتصاص جزيئات فيروسية عن طريق حساب متوسط اليكسا فلور (AF) 647 إشارة في مناطق مختارة في الورم أو في سدى (غير منطقة الورم) باستخدام صورة البرنامج الكميات مثل Volocity (بيركن إلمر). تم احتساب نسبة سدى الورم لبقسمة يعني AF 647 إشارة في الورم أكثر من 647 إشارة تعني بالعربية في سدى. وهناك نسبة الورم / سدى أعلى من 1 يشير إلى أن جسيمات متناهية الصغر التي يجري اتخاذها من قبل الورم.
5. ممثل النتائج :
في المثال الموصوفة هنا ، نحن حقن HT - 29 خلايا سرطان القولون لتشكيل بلعة 1MM تقريبا في الحجم داخل CAM لأجنة الدجاج يوم 9 (1B الشكل). بعد التلقيح ، ومثقف الأجنة لمدة 7 أيام في حاضنة ترطيب كافية للسماح لنمو الورم والأوعية الدموية (الشكل 1C). تم حقن في الوريد مع أجنة ديكستران منخفضة الوزن الجزيئي لتأكيد ورم الأوعية الدموية ، وكانت تصور الأورام تحت المجهر زايس Z1 AxioExaminer تستقيم (الشكل 2D).
بعد الوريد من CPMV AF - 647 - CPMV أو PEG - AF النانوية 647 (الشكل 3A و ب) ، ذات الدقة العالية وكشف في الوقت الحقيقي مبائر التصوير (الشكل 2E) أن كلا من CPMV CPMV والربط بين جزيئات المسمى بسرعة الأوعية الدموية بأكملها ، ولكن وكان الإقبال على CPMV - PEG من الورم ما يقرب من 3 أضعاف CPMV بعد 12 ساعة (الشكل 3A). تم تحديد امتصاص الورم النسبية للجزيئات باستخدام برمجيات تحليل الصور (Volocity من إلمر بيركن). وقد تم اختيار مناطق ذات الاهتمام داخل وخارج الورم (في المقصورة اللحمية) وتحديد كثافة يعني كل مضان. وأعرب عن البيانات كما ورم / سدى النسبة.
الشكل 1. Microinjection الأورام في CAM للجنين الطيور. (أ) تجميع جهاز microinjection من المكونات كما هو محدد. (ب) أجنة الطيور في يوم 9 جاهزة للتلقيح مع الورم عندما انتشر CAM لتغطية كامل السطح. (ج) في يوم 16 ، ونمت على الورم لمدة تصل إلى 1 سم في القطر (خط متقطع) ومستعد لحقن مع النانوية.
الشكل 2. حقن جسيمات متناهية الصغر والتصوير intravital. الحقن تحت المجهر يظهر تشريح (أ) رأس الإبرة microinjector جاهزة للحقن في الوريد CAM و (ب) الإبرة microinjector إدراجها في الوريد (المشار إليها بواسطة السهم) وجزيئات حقنها في تدفق الدم (التي اطلعت عليها المقاصة من الدم). (ج) وحدة التصوير التي تحتوي على جنين الطيور مع ساترة ربطه مباشرة مع CAM. (د) قبل حقن جسيمات متناهية الصغر ، ويتم تقييم الأوعية الدموية السرطانية باستخدام التصوير intravital بعد حقن ديكستران فلوريسئين. (ه) وحدة التصوير التي تحتوي على الجنين وضعه على المسرح مجهر an مبائر تستقيم ضمن درجة حرارة التنظيم مجموعة الضميمة إلى 37 درجة مئوية.
الشكل 3. التصور Intravital امتصاص جزيئات النانو في الأورام الإنسان. الأورام هي تصور 7 ساعات بعد الحقن (أ) CPMV - AF647 و (ب) AF647 - CPMV - PEG. د) لاستئصال ورم من جنين الطيور لتحليلها لاحقا.
Discussion
غشاء مشيمائي (CAM) من جنين الطيور نموذجا مفيدا لتقييم ديناميات الوعائية والدوائية للأورام البشرية. هيكل وموقف يسمح CAM عالية الجودة والحصول على الصور من يستوعب العديد من أنواع السرطان من دون xenografts العمليات الجراحية الغازية. علاوة على ذلك ، xenografts ورم السرطان المزروع في غشاء مشيمائي تصبح أوعية دموية في غضون 7 أيام ، وتقدم سريع وغير مكلف وشبه عالية الإنتاجية إلى تقييم تراكم النانوية في الأنسجة السرطانية. ويمكن منذ xenografts سرطان زرع في لأجنة الدجاج CAM قذيفة أقل متاحة للبصريات ذات دقة عالية لمجهر أو تستقيم epifluorescence مبائر والمعلومات السياقية والزمنية المتعلقة امتصاص جسيمات متناهية الصغر في الأوعية الدموية السرطانية يمكن الحصول عليها بسهولة. xenografts السرطان في هذا النموذج تميل إلى النمو أفقيا عبر CAM ، مما أدى في الأورام التي تكون كبيرة في حين تبقى أقل من 200 متر في عمق. هذا يجعلها مناسبة بصفة خاصة للتصوير intravital لأن المجاهر epifluorescence معيار يمكن ان تخترق بشكل فعال كتلة الورم بأكمله. في المقابل ، الأورام مزروع في مواقع إما سطحية أو مثلي داخل الماوس تتكاثر في ثلاثة أبعاد ، مما يجعل من الصعب حصر دقيق النانوية عميقة داخل هذه الأورام من غير الغازية التقنيات. وقد استخدمت هذا النموذج نحن لتقييم امتصاص نقاط الكم ، والجسيمات الشحمية ، وأكسيد الحديد النانوية في عدد من ورم xenografts الإنسان ، وإبراز إمكانيات هذا النموذج لتكون مناسبة للتحليل في الجسم الحي من مجموعة واسعة من الصيغ جسيمات متناهية الصغر.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل # 700537 CCSRI غرانت وCIHR المنحة # 84535 لرابطة الدفاع اليهودية والمعاهد الوطنية للصحة / NCI منح # CA120711 - 01A1 - 01A1 وCA120711 إلى الألف إلى الياء. أجريت جميع التجارب وفقا للوائح ومبادئ توجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو ، ورعاية الحيوان واستخدم في جامعة ويسترن اونتاريو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
