Summary
Vi presenterar en ny metod för att kvantifiera nanopartiklar lokalisering i kärlsystemet mänskliga xenografted tumörer med dynamisk realtidsinformation intravital avbildning i en aviär embryo modell.
Abstract
Nuvarande teknik för bildgivande, såsom ultraljud, MRI, PET och CT, är oförmögna att ge högupplösta bilder för bedömning av nanopartiklar upptag i tumörer på mikroskopisk nivå 1,2,3 och belyser nyttan av en lämplig xenograft modell på sig att utföra detaljerade upptag analyser. Här använder vi högupplösta intravital avbildning för att utvärdera nanopartikel upptag i human tumörvävnad implanterad i en modifierad, skal-mindre kyckling embryo modell. Kycklingen embryot Modellen är särskilt väl lämpad för dessa in vivo-analyser, eftersom det stöder tillväxten av mänskliga tumörer, är relativt billigt och inte kräver anesthetization eller kirurgi 4,5. Tumörceller bildar helt vaskulariserad xenografter inom 7 dagar när implanteras i chorioallantoic membran (CAM) 6. Den resulterande tumörer visualiseras genom icke-invasiv i realtid, med hög upplösning avbildning som kan bibehållas i upp till 72 timmar med liten påverkan på antingen värd eller tumör system. Nanopartiklar med ett brett utbud av storlekar administreras och formuleringar distalt om tumören kan visualiseras och kvantifieras, eftersom de flyter genom blodomloppet, extravasera från läckande tumörvaskulatur och ansamlas i tumören. Vi beskriver här en analys av nanopartiklar från Cowpea viruset (CPMV) dekorerad med nära infraröda fluorescerande färger och / eller polyetenpolymerer (PEG) 7, 8, 9,10,11. Vid intravenös administrering är dessa virus nanopartiklar snabbt internaliseras av endotelceller, vilket resulterar i global märkning av kärlen både utanför och inom tumören 7,12. PEGylering av viral nanopartiklar ökar deras halveringstid i plasma, förlänger sin tid i cirkulationen, och i slutändan ökar deras ackumulering i tumörer genom förbättrad permeabilitet och retention (EPR) effekt 7, 10,11. Hastighet och grad av ackumulering av nanopartiklar i en tumör mäts över tid med hjälp av programvara bildanalys. Denna teknik ger en metod för både visualisera och kvantifiera nanopartikel dynamiken i mänskliga tumörer.
Protocol
1. Inympning av tumör i aviär embryo CAM
- Förbered skal mindre befruktade kyckling embryon som beskrivs 8.
- Dag 9 av embryonal utveckling, monterar en mikro-injektor med hjälp av en 18-gauge nål kopplas in på 1 ml sprutan. Skär en 5-6 inches bit Tygon slang (1 / 32 "innerdiameter, 3 / 32" ytterdiameter, 1 / 32 "tjocklek) och noggrant in avfasning av nålen i slangen. Ca 4-5 inches av slangen ska sträcker sig från nålspetsen (Figur 1a).
- Fyll sprutan och slangen med cellsuspension. Sedan sätter en nål mikroinjektion glas i slutet av slangen och försiktigt avlägsna eventuella luftbubblor.
- Injicera Dag 9 embryon (Figur 1b) under en dissektion räckvidd med en belysning med 10,000-100,000 cancerceller som en bolusdos inom CAM (Figur 1c). Injicera långsamt celler och noga se till att nålen är i rätt plats för cellerna att bilda en synlig bolusdos inom CAM. Celler som droppa in på CAM-ytan kan rengöras med Kimwipe eller annan applikator.
- Återgå embryon till fuktad inkubator vid 38 ° C vid 60% luftfuktighet och låta tumören att växa och vascularize (upp till 7 dagar).
2. Beredning av nanopartiklar
- För att förbereda fluorescerande CPMV nanopartiklar för injektion i kycklingen embryot, späda den virala nanopartiklar (syntetiseras som i 8 i PBS, pH 7,4, till en koncentration av 100 mikrogram / ml Vortex blandningen väl före användning och centrifugera i en minut för att ta bort. aggregat. sonication kan också vara bra beroende på konjugat och graden av aggregering. Lagren av fluorescerande CPMVs är stabila i minst 1 år vid förvaring vid 4 ° C i mörker. Kontrollera lagren med jämna mellanrum genom att sätta ett par droppar på en glasskiva och kontroll av fluorescens. transmissionselektronmikroskopi (TEM) kan också användas för att avgöra om partiklarna var intakt efter konjugering.
- Kortfattat kan ett mikrogram av viral nanopartiklar (i en slutlig volym av 2 l) läggas till koppar belagda nät. Lägg sedan en lika stor volym 2% AUC acetat i 1 minut vid elektronmikroskop (Philips EM 410).
3. Intravenös injektion av fluorescerande-märkta virus nanopartiklar
- Dag 16, montera mikro-injektor som beskrivits ovan. Dra upp önskad volym av virus nanopartiklar genom slangen i sprutan (> 200 mikroliter). Ta försiktigt bort eventuella luftbubblor. In kanylen mikroinjektion glas i slutet av slangen. Se till att nålen är så lång och avsmalnande som möjligt (Figur 2a). Om nålen är för trubbigt, kommer det inte att kunna tränga igenom ektoderm och kommer att misslyckas med att tränga in i fartyget. Om nålen är för skarpt, kommer spetsen kollapsa när genomträngande vävnad.
- Intravenöst injicera 100 l 1 mg / ml fluorescein dextran (MW 70.000 Da, Invitrogen) i tumören med embryo distala från önskad webbplats ska visualiseras (figur 3d). Framgångsrik kanylering av CAM ven framgår av clearing av blod i vägen för injektionen flöde (Figur 2b). Bedöm vaskulär läcka 1 timme efter injektionen.
- Intravenöst injicera 50 ìl av 1 mg / ml lösning av CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) eller pegylerat CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) i embryon med tumörer med vaskulär läcka distala från den önskade platsen till visualiseras.
- Bild tumörer omedelbart och varje timme efter injektion med en Zeiss Examinator Z1 upprätt mikroskop utrustat med en Yokogawa snurrande skiva, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD-kamera.
4. Realtid intravital imaging
- För att montera enheten embryot bildbehandling, applicera ett tunt lager vakuum fett runt omkretsen av imaging-porten på undersidan av locket av embryot bildbehandlingsenheten, och passa en 18 täckglas mm glas på porten.
- Placera embryot så att täckglas täcker önskat område för avbildning. Sakta sänker lock tills täckglas bara tar kontakt med embryot, och sedan skruva på locket på enheten för att hålla den på plats (Figur 2c).
- Tillsätt vatten uppvärmt till 37 ° C i embryot bildbehandlingsenheten utanför skålen som innehåller embryot och placera hela enheten på scenen i en upprätt konfokalmikroskop med insidan klimatkammare jämvikt till 37 ° C.
- Placera bildbehandlingsenheten innehåller embryot under Spinning disken konfokala fluorescensmikroskop (figur 2e). Bildbehandlingsenheten kommer att hålla embryot på plats och hålla synfältet fast samtidigt fånga bilder, vilket möjliggör både tredimensionella Z stackar och Time-lapse bilder som ska fångas. Vi förvärvar och analysera tredimensionella tidsförlopp bilder med Perkin Elmer (tidigare Improvisation) Volocity programvarupaket (figur 3a). Skaffa en högupplöst tredimensionell stack av tumören och omgivande kärlsystemet att visualisera detailed strukturella analyser vid viss tid-poäng. Förvärva tredimensionella stackar vid vanlig tid-poäng för att kartlägga detaljerade strukturella förändringar i tumörvaskulatur. Bild tumörer varje timme efter injektionen.
- Kvantifiera upptaget av virus nanopartiklar genom att beräkna medelvärdet Alexa Fluor (AF) 647-signal inom utvalda områden i tumören eller i glatta (icke-tumör-området) med hjälp av bild kvantifiering program som Volocity (Perkin Elmer). Tumören till stromat uppgick beräknas genom att dividera den genomsnittliga AF 647 signal i tumören över medelvärdet AF 647 signal i stroma. En tumör / stroma kvot högre än 1 indikerar att nanopartiklar kommer att tas upp av tumören.
5. Representativa resultat:
I exemplet som beskrivs här, injiceras vi HT-29 koloncancerceller att bilda en bolusdos ungefär 1 mm i storlek inom CAM på dagen 9 kyckling embryon (Figur 1b). Efter vaccinationen var embryon odlade i 7 dagar i en fuktig kuvös för att tillåta tillräcklig tumörtillväxt och vaskularisering (figur 1c). Embryon injiceras intravenöst med låg molekylvikt dextran att bekräfta tumör vaskularisering, och tumörer visualiseras enligt Zeiss AxioExaminer Z1 upprätt mikroskop (figur 2d).
Efter intravenös administrering av CPMV-AF 647 eller CPMV-PEG-AF 647 nanopartiklar (figur 3a och b), hög upplösning i realtid konfokala imaging (figur 2e) visade att både CPMV och CPMV-PEG nanopartiklar snabbt märkt hela kärlsystemet, men upptag av CPMV-PEG av tumören var ungefär 3 gånger högre än CPMV efter 12 timmar (Figur 3a). Den relativa tumör upptaget av nanopartiklar har fastställts med hjälp av programvara bildanalys (Volocity från Perkin Elmer). Regioner av intresse valdes ut inom och utanför tumören (i stromaceller facket) och den genomsnittliga fluorescensintensiteten varje fastställdes. Data är uttryckt som tumör / stroma förhållande.
Figur 1. Mikroinjektion av tumörer i CAM av en aviär embryo. (A) mikroinjektion apparaten är monterad från komponenter som anges. (B) Aviär embryon på dag 9 är redo att ympas med tumör när CAM har spridit sig att täcka hela ytan. (C) vid dag 16, kommer att tumören har vuxit upp till 1 cm i diameter (streckad linje) och är klar för injektion med nanopartiklar.
Figur 2. Nanopartiklar injektion och intravital avbildning. Injektion under en dissektion förstoringsglas som visar (a) spets microinjector nålen färdig att injiceras i CAM ven och (b) microinjector nål sätts in i venen (anges med pil) och nanopartiklar injiceras i blodflödet (sett genom att rensa av blod). (C) Bildenhet innehåller aviär embryo med täckglas gränssnitt direkt med CAM. (D) Före nanopartiklar injektion tumör vaskularisering utvärderas med hjälp intravital avbildning efter injektion av fluorescein dextran. (E) Bildenhet innehåller embryot placeras på scenen i en upprätt konfokalmikroskop inom ett temperatur-reglerad kapsling satt till 37 ° C.
Figur 3. Intravital visualisering av nanopartiklar upptag i mänskliga tumörer. Tumörer visualiseras 7 timmar efter injektion av (a) CPMV-AF647 och (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excision av tumör från aviär embryo för senare analys.
Discussion
Den chorioallantoic membran (CAM) av aviär embryot är en användbar modell för att bedöma vaskulära dynamik och farmakokinetik av mänskliga tumörer. Strukturen och position CAM tillåter hög förvärv bildkvalitet och rymmer många typer av cancer implanterad utan kirurgiska ingrepp. Dessutom cancer tumörxenografter implanteras i chorioallantoic membranet blir vaskulariserad inom 7 dagar, som erbjuder ett snabbt, billigt och halv-hög genomströmning metoder för att bedöma en ackumulering av nanopartiklar i tumörvävnad. Eftersom cancer implanterad implanteras i CAM skal mindre kyckling embryon är tillgängliga för den högupplösta optik av en rät epifluorescence eller konfokalmikroskop, kontextuella och tidsmässiga information om nanopartikel upptag i tumörvaskulatur lätt kan erhållas. Cancer implanterad i den här modellen tenderar att växa i sidled över CAM, vilket resulterar i tumörer som är stora samtidigt som den är mindre än 200 m djup. Detta gör dem särskilt väl lämpad för intravital avbildning eftersom standarden epifluorescence mikroskop effektivt kan tränga igenom hela tumören massa. Däremot tumörer implanteras i antingen ytlig eller orthotopic platser inom musen förökar sig i tre dimensioner, vilket gör det svårt att exakt lokalisera nanopartiklar djupt inom dessa tumörer av icke-invasiva metoder. Vi har använt denna modell för att bedöma upptag av kvantprickar, liposomer och nanopartiklar av järnoxid i ett antal humana tumörxenografter att belysa de potentiella för denna modell vara lämpliga för in vivo analys av ett brett utbud av nanopartiklar formuleringar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av CCSRI Grant # 700.537 och CIHR Grant # 84.535 till JDL och NIH / GNI bevilja # CA120711-01A1 och CA120711-01A1 till AZ. Alla försök utfördes i enlighet med de regler och riktlinjer för Institutional Animal Care och använda kommittén vid University of California San Diego, Animal skötsel och användning vid University of Western Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
