جرى التحقق من طريقة للحفاظ على ، والكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي ومن فيروسات أنفلونزا الطيور وباستخدام عينات البراز مدد الطبيعي من الطيور. يزيل هذا الأسلوب على ضرورة الحفاظ على سلسلة التبريد ومعالجة الفيروسات المعدية ويمكن تطبيقها في إعداد عالية الإنتاجية 96 – جيدا.
فيروسات أنفلونزا الطيور (AIVs) تصيب العديد من الثدييات ، بما في ذلك البشر 1. هذه AIVs متنوعة في مضيفيهم الطبيعية ، وإيواء ما يقرب من جميع الأنواع الفرعية ممكن الفيروسية 2. الأوبئة البشرية بانفلونزا الجذعية أصلا من AIVs 3. وأبلغ العديد من حالات الوفاة البشرية خلال تفشي فيروس H5N1 في السنوات الأخيرة. في الآونة الأخيرة ، سلالة جديدة تتعلق AIV اجتاحت البشر ، مما تسبب في (4) ، "وباء انفلونزا الخنازير. على الرغم من أن تجارة البشر ونشاط النقل ويبدو أن المسؤولين عن انتشار سلالات شديدة العدوى 5 ، ويمكن أيضا نثر يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى الطيور البرية 6 ، 7. ومع ذلك ، فإن الخزان الفعلي لجميع سلالات AIV والطيور البرية.
في رد فعل على هذا ، وفي مواجهة الخسائر التجارية الشديدة في صناعة الدواجن ، وقد تم تنفيذ برامج للمراقبة واسعة على مستوى العالم لجمع معلومات عن البيئة من AIVs ، وتركيب أنظمة الإنذار المبكر للكشف عن بعض السلالات الشديدة الإمراض 8-12. الأساليب التقليدية تتطلب الفيروسي الفيروسات لتكون سليمة وزراعتها قبل التحليل. هذا يتطلب سلاسل باردة صارمة مع التجميد العميق والثقيلة إجراءات السلامة البيولوجية ليكون في المكان أثناء عملية النقل. ولذلك فإن المراقبة على المدى الطويل يقتصر عادة على محطات قليلة على مقربة من حقل مختبرات مجهزة تجهيزا جيدا. لا يمكن أخذ عينات المناطق النائية ما لم يتم تنفيذ إجراءات معقدة لوجستيا. وقد اعترفت هذه المشاكل 13 و 14 ، واستخدام التخزين والاستراتيجيات البديلة للنقل التحقيق (الكحول أو الجوانيدين) 15-17. مؤخرا ، قدمت كراوس وآخرون 18 وسيلة لجمع وتخزين ونقل عينات AIV ، استنادا إلى ورقة مرشح خاص. اتفاقية التجارة الحرة بين الحفاظ على بطاقات 19 RNA على أساس التخزين الجاف 20 وتجعل مسببات الأمراض غير نشط عند الاتصال 21. وأظهرت هذه الدراسة أنه يمكن استخدام بطاقات اتفاقية التجارة الحرة للكشف عن الحمض النووي الريبي في AIV عكس النسخ PCR والتي يمكن أن تكون متسلسلة والناتجة [كدنا] والجينات وتحديد الفيروس.
في دراسة كراوس وآخرون (18). مختبر عزل من كان يستخدم AIV ، وجرى التعامل مع عينات بشكل فردي. في ملحق المعروضة هنا ، تم اختبار عينات البراز من الطيور البرية من فخ بطة في مرصد الطيور Ottenby (SE السويد) مباشرة لتوضيح جدوى الأساليب في الظروف الميدانية. اصطياد البط وجمع عينة من مسحات المذرقية يتجلى. البروتوكول الحالي يتضمن الارتقاء في التعامل مع تدفق العمل من أنبوب واحد لتصميم 96 – جيدا. وإن كانت أقل حساسية من الطرق التقليدية ، وطريقة تشفير البطاقات توفر تكملة ممتازة لمراقبة خطط كبيرة. أنها تسمح لجمع وتحليل عينات من أي مكان في العالم ، دون الحاجة إلى الحفاظ على سلسلة تبريد أو أنظمة السلامة فيما يتعلق شحن الكواشف الخطرة مثل الكحول أو الجوانيدين.
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة إضافية لعينات البراز الشاشة أو ما شابه ذلك لوجود AIV. وقد صممت خصيصا لجعل جمع العينات سريعة وسهلة. هذا يجعل من الممكن للأشخاص أقل المدربين ، مثل الصيادين أو مديري الحياة البرية ، والمساهمة في مراقبة منظمة العفو الدولية. لا سلاسل باردة ينبغي أن تطبق ، على الرغم من تجميد العينات ويوصى حيثما أمكن ذلك. وبعد أيام قليلة من درجة حرارة الغرفة ، على سبيل المثال أثناء النقل إلى المختبر ، لم تكن مشكلة لجزيئات الحمض النووي الريبي على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة ، وطالما بقيت هذه البطاقات الجافة. غيرها من نظم التخزين غير المبردة التي يتم تقييمها حاليا من قبل مجتمع البحوث ، مثل الكحول أو 15 أو 16 الجوانيدين ، تتطلب ترتيبات الشحن الخاصة بسبب طبيعتها الخطرة. في المقابل ، فإن الأسلوب بطاقة اتفاقية التجارة الحرة لا تتطلب النقل البحري للمواد الخطرة. ومع ذلك ، وسيلة أخرى للتخزين للاهتمام في هذا الصدد هو RNAlater ™ التي ليست خطرة ، إما 17. يمكن أن يتم تحليل العينات في المختبرات أي الجزيئية القياسية. ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة بخلاف المعتاد لتفاعلات PCR وتسلسلها الشعري. ويمكن تنفيذ كافة الخطوات دون مستوى السلامة الحيوية لأن فعلا في جمع العينات والمعطل في العوامل المسببة للأمراض محتملة من النشاط المضاد للبكتيريا وفيروسات من بطاقة اتفاقية التجارة الحرة.
لم تراع عبر تلوث واللاحقة عينات إيجابية كاذبة في تجاربنا مع عينات من الطيور البرية. ومع ذلك ، عند العمل مع RNA PCR وأنه من المستحسن دائما أن تولي اهتماما خاصا لتنظيف أماكن العمل وغرف منفصلة للخطوات السابقة واللاحقة PCR. العمل في غطاء الدخان يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي في المختبر. Pipetting الاحتياجات التي يتعين الاضطلاع بها مع نصائح التصفية.
من دراسة سابقة على عينات أخذت في وقت واحد من البط نفسه نحن نعرف أن ستة من عينات 84 كانت ايجابية من قبل الحقيقي التقليدية RT – PCR الأسلوب (24) والقيم ط الحقيقي من RT – PCR المعروفة. العينتين إيجابية الكشف عنها بواسطة القضاء لدينا وسيلة من البط التي كانت القيم ط <30 (يشير إلى وجود نسبة عالية من الحمض النووي الريبي الفيروسي). وكان الأربعة الأخرى التي كانت إيجابية العينات مع بروتوكول القيم التقليدية لا يمكن ط> 30 (أقل تركيزا) ، ويمكن الكشف عنها بواسطة بروتوكول لدينا.
وكانت عينات من الفيروس فقط مع التتر ايجابية عالية نسبيا في مقايسة لدينا وأنه من المرجح أن حساسية الأسلوب هو مصدر عدم الكشف عن عينات إيجابية. كذلك ، كان حجم العينة في الدراسة الحالية منخفضة جدا ويمكن أن تكون طريقة تم تطويرها بالكامل وتقييمها إذا نفذت تجارب أكثر صرامة للرقابة والخروج. ومع ذلك ، إذا كان من هذه العينات التي تم جمعها من مناطق نائية ، فإن التحليل التقليدي لم يكن ممكنا على الإطلاق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النتائج الأولى تنبع من التجارب الرائدة التي تحتاج إلى مزيد من التحسين. فترة التخزين سنتين في الثلاجة العادية -20 درجة مئوية بعد جمع العينات ربما يؤثر أيضا على نوعية RNA الفيروسي. هذا التدهور RNA ممكن هو قضية هامة عند التعامل مع تخزين درجة حرارة الغرفة من الفيروسات المعطلة. العينات المخزنة في السوائل البديلة على النحو المذكور أعلاه تعاني من تدهور كبير مما يؤثر تحليل تمتد أطول من الجينوم الفيروسي 16. على الرغم من عدم اختباره في دراستنا ، فقد أثبتت اتفاقية التجارة الحرة لبطاقات تكون مناسبة تماما للحفاظ على سلامة جزيئات الحمض النووي الريبي RNA في النظم الأخرى التي هي مشابهة جدا لفيروسات أنفلونزا الطيور 25 و 26.
The authors have nothing to disclose.
نشكر Dibbits بيرت لتقديم المساعدة التقنية. وتربية الحيوان وعلم الجينوم الفريق ، جامعة فاغينينغين ، هولندا ، استضافت بسخاء لنا في المختبرات الخاصة بهم. وشكر العاملين في مرصد الطيور Ottenby ، السويد ، لمحاصرة وأخذ عينات من البط البري ، في Hellström ماغنوس وجه الخصوص ، ماركوس دانييلسون ، ماجنوسون كريستوفر اندرسون وستينا. نشكر Sanne سفينسون ، Qvist Jonatan ولكل أكسل Gjöres للتصوير في Ottenby وCamon مانو للتصوير في المختبر. قدم دانيال Bengtson صور بطة جميلة لجزء الفيديو من هذا المنشور. ، ومواد مجانية أخرى من المكتبة العامة في مركز السيطرة على الأمراض صورة الصحة (فيل http://phil.cdc.gov/phil/ كانت تستخدم) : إن صورة مجهرية الإلكترون (رقم 280 ؛ التي كتبها الدكتور إرسكين بالمر) والتوضيح (رقم 11823 ؛ من قبل دوغلاس الأردن) من فيروس الانفلونزا. وقدم الدعم المالي من قبل KNJV (رويال هولندا جمعيه الصيادين) ، وزارة الزراعة الهولندية ، وFaunafonds ومؤسسة Stichting دي Eik صناديق (سواء في هولندا) ، ومجلس الأبحاث السويدي (منحة رقم 2007-20774) والمفوضية الأوروبية Newflubird في تأسيس المشروع. وكانت المواد الكيميائية العزلة RNA هدية سخية من Ambion ، وشركة ، وشركة رنا. هذه هي مساهمة رقم 245 من مرصد Ottenby الطيور.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |