Summary
Eine Methode, um zu bewahren, zu erkennen und Sequenz der RNA von Vogelgrippeviren wurde validiert und erweitert mit natürlichen Kotproben von Vögeln. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung einer Kühlkette und Handhabung von infektiösen Viren und kann in einer 96-well High-Throughput-Setup verwendet werden.
Abstract
Vogelgrippeviren (AIVs) infizieren viele Säugetiere, einschließlich Menschen 1. Diese AIVs sind in ihren natürlichen Wirten diverse, Beherbergung fast alle möglichen viralen Subtypen 2. Menschliche Pandemien von Grippe ursprünglich stammen aus AIVs 3. Viele tödliche Fälle bei Menschen während der H5N1-Ausbrüche in den letzten Jahren gemeldet wurden. In letzter Zeit, ein neues AIV verbundenen Belastung durch die menschliche Bevölkerung gefegt, so dass die "Schweinegrippe-Epidemie" 4. Obwohl menschlichen Handels-und Transport-Aktivität verantwortlich zu sein scheint für die Ausbreitung der hoch pathogenen Stämmen 5, kann die Verbreitung zum Teil auch auf Wildvögel 6, 7 zurückgeführt werden. Allerdings ist die tatsächliche Reservoir aller AIV-Stämme Wildvögeln.
In Reaktion auf diese und angesichts der schweren wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügel-Industrie, haben große Überwachungs-Programme weltweit, um Informationen über die Ökologie der AIVs sammeln und Frühwarnsysteme zu installieren, um bestimmte hoch pathogenen Stämmen 8-12 erkennen umgesetzt. Traditionelle virologischen Methoden erfordern Viren intakt zu sein und kultiviert vor der Analyse. Dies erfordert strenge Kälte-Ketten mit Tiefkühltruhen und schwere Biosicherheit Verfahren, um im Platz während des Transportes werden. Langfristige Überwachung ist daher in der Regel ein paar Feldstationen in der Nähe gut ausgestattete Labors beschränkt. Abgelegene Gebiete können nicht abgetastet, es sei denn logistisch schwerfällige Verfahren umgesetzt werden. Diese Probleme wurden 13 anerkannt, 14 und die Nutzung alternativer Lagerung und Transport Strategien untersucht (Alkohole oder Guanidin) 15-17. Kürzlich führte Kraus et al. 18 a Verfahren zur Erhebung, Speicherung und Transport AIV Proben, basierend auf einem speziellen Filterpapier. FTA Karten 19 erhalten RNA auf eine trockene Lagerung Basis 20 und machen Krankheitserreger inaktiv bei Kontakt 21. Diese Studie zeigte, dass FTA-Karten verwendet werden, um AIV RNA in Reverse-Transkriptions-PCR und die daraus resultierende cDNA konnten sequenziert und Virus-Gene ermittelt und nachgewiesen werden.
In der Studie von Kraus et al. 18 a Labor zu isolieren von AIV verwendet wurde, und die Proben wurden einzeln behandelt. In der Verlängerung hier präsentierten, wurden Kotproben von Wildvögeln aus der Ente Falle am Ottenby Bird Observatory (SE Schweden) direkt an den Nutzen der Methoden unter Feldbedingungen illustrieren getestet. Fangen von Enten und Probenentnahme durch Kloakenabstriche demonstriert. Das aktuelle Protokoll enthält up-scaling der Arbeitsabläufe aus einzelnen Röhre Umgang mit einer 96-well-Design. Obwohl weniger empfindlich als die traditionellen Methoden bietet die Methode der FTA-Karten eine hervorragende Ergänzung zu große Überwachungssysteme. Es ermöglicht Erfassung und Analyse von Proben aus der ganzen Welt, ohne die Notwendigkeit zur Aufrechterhaltung einer Kühlkette oder Sicherheitsvorschriften in Bezug auf Transport von gefährlichen Reagenzien, wie Alkohol oder Guanidin.
Protocol
1. Ente Trapping und Kloake Abstrich
- Trap-Schwimmenten der Gattung Anas (oder andere Vögel) in einem Käfig durch die Gewinnung von ihnen locken Enten oder Essen, und legte sie in die einzelnen Kartons. Transportation Zeit in der Box sollte auf ein Minimum reduziert werden, zum Beispiel durch den Einbau einer Feldstation in kurzer Entfernung zur Falle. Logistic Umständen in jeder Studie variieren. Die Beratung und Zustimmung der zuständigen Ethikkommission Tier muss für jedes neue Set-up gesucht werden. Alternativ kann auch Jäger abgeschossene Vögel abgetastet werden kann.
- Nehmen Sie die Ente aus dem Kasten, indem die Flügel fest an seinen Körper. Probe eine frische fallen, die vorhanden sein wird in den meisten Fällen direkt aus dem Boden der Schachtel. Wählen sie mit einem sterilen Tupfer und wenden Sie die Flüssigkeit in einen Whatman FTA-Karte. Wenn nicht, führen Sie Kloake Abstrich.
- Schalten Sie die Ente auf dem Rücken. Dies ermöglicht den Zugriff auf die Kloake und erleichtert Probenahme. Die Kloake ist eine vorstehende Struktur unter dem Bauch, in der Nähe der Basis des Schwanzes entfernt. Eine erfahrene Person halten konnte und probieren Sie die Vögel zur gleichen Zeit, oder auch eine zweite Person helfen kann.
- Schieben Sie die sterile Kunststoff-Rayon Tupfer (Copan, Italien) ca. 1 cm und eine sanfte Wirbel aus der Kloake. Rollen Sie den Tupfer mit der Flüssigkeit aus der Kloake über die Oberfläche eines Whatman FTA-Karte. Nach der Probenahme wurde durchgeführt sofortige Freilassung des Tieres ist wünschenswert.
- Trocknen Sie die FTA-Karten bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde, dann speichern Sie jede Probe einzeln in Papiertüten (z. B. Briefumschläge). Lagerung bei Raumtemperatur möglich, eventuell mit Silica-Kügelchen in feuchtem Klima. Das Senden und Empfangen von Institutionen Biosicherheitsbeauftragte erlauben kann, um FTA-Karten per Post zu schicken, da die Erreger inaktiv bei Kontakt mit der FTA-Karte Oberfläche geworden.
2. Viral RNA Isolation
- Entpacken Sie die FTA-Karte Material, einschließlich Fäkalien / Kloake Flüssigkeit. Punsch drei Scheiben mit einem Harris 2 mm Puncher und Ort all jene in eine Vertiefung einer RNase frei 96well Platte. Zwischen jeder neuen Probe, reinigen Sie die Puncher vorsichtig mit Alkohol und einem Kim Präzision wischen (Kimtech). Verwenden Sie immer positive und negative Kontrollen. Eine positive Kontrolle kann von einem Labor-Stamm frisch eine FTA-Karte aufgetragen, oder eine natürliche Probe, die wissen, um ein positives Ergebnis liefern wird bestehen. Als Negativ-Kontrolle, Punch-Out-Discs aus einem leeren FTA-Karte. Darüber hinaus lassen andere auch frei für eine PCR-Kontrolle später im Experiment (mit Wasser als Vorlage).
- Add 70μl RNA schnelle Extraktionslösung (Ambion) und Wärme-Siegel der Platte (ABgene Thermo-Sealer). Inkubieren 5 Minuten auf einem Schüttler bei Raumtemperatur mit der ermittelten Geschwindigkeit, die nicht dazu führt, spill-over (dies hängt von der verwendeten Platten-Schüttler-Modell; Test im Voraus).
- Carry virale RNA-Isolierung nach den Protokollen des Herstellers mit dem MagMax-96 virale RNA Isolation Kit (Ambion). In Kürze: Fügen Sie 130μl vorbereitet Lysis / Lösung (aus dem Kit) in jede Vertiefung. Transfer-50 ul extrahiert FTA-Karte Material in jede Vertiefung. Schütteln Platte für 1 Minute.
- Add 20 &mgr; l vorbereitet Bead-Mix (aus dem Kit) zu jeder Probe und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. Schütteln Sie auf bestimmte Geschwindigkeit für 5 Minuten. RNA-Moleküle werden an die magnetischen Kügelchen binden.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen 96-well stehen, um die Perlen zu erfassen. Je nach Modell der magnetischen Ständer verwendet, kann dies länger als 5 Minuten. Wenn die Lösung hat sich ganz klar, zu entfernen und den Überstand verwerfen. Dann entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Waschen Sie die Kugeln zweimal mit Waschlösung 1 und zweimal mit Waschlösung 2 (aus dem Kit). Für jede der 4 Waschschritte 150 &mgr; l vorbereitet Waschlösung hinzufügen zu jeder Probe, shake für 1 Minute auf bestimmte Geschwindigkeit bewegen sich die Platte an den magnetischen stehen, zu erfassen Perlen für ca. 5 Minuten (oder bis die Lösung völlig klar ist), zu entfernen und den Überstand verwerfen. Dann entfernen Sie die Platte aus dem magnetischen stehen, fügen Sie den nächsten Waschlösung und Durchführung der Waschschritte wie zuvor. Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie so viel Waschlösung wie möglich und an der Luft trocknen die Kügelchen bei Raumtemperatur in den Platten-Schüttler für 2 Minuten.
- Add 50 ul Elutionspuffer (aus dem Kit), um RNA aus den Kügelchen lösen und schütteln für 4 Minuten auf dem Schüttler. Capture-Perlen wie zuvor beschrieben. Der Überstand enthält nun die isolierte RNA, die bereit sind für nachgelagerte Anwendungen ist.
3. RT-PCR des AIV Matrix Gene
Führen Sie die reverse Transkription PCR (RT-PCR) mit dem One-Step RT-PCR Zugang Systems (Promega) in 25 ul Reaktionen (bereinigt von Kraus et al 18 und Fouchier et al 22..):
| Nuclease freies Wasser | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 Puffer 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| Primer M52C 22 (10 nM) | 2.5μl |
| Primer M253R 22 (10 nM) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| AMV-Reverse-Transkriptase (5u/μl) | 0.5μl |
| Tfl-Polymerase (5u/μl) | 0.5μl |
| RNA-Probe | 5μl |
PCR-Bedingungen in einem Biometra T1 Thermocycler sind: initial reverse Transkription von 45 Minuten bei 45 ° C, um 2 Minuten initiale Denaturierung bei 94 ° C und 40 Zyklen: 94 ° C für 1 Minute, 56 ° C für 1 Minute und 68 ° C für 2 Minuten. Eine weitere 7 Minuten Dehnung bei 68 ° C schließt die Verstärkung.
4. Screening für AI-positive Proben und Reinigung von Targeted Fragmente aus Gel
- Laden 2μl des PCR-Produktes mit 2μl 5x Ladepuffer (BioRad) und 6μl Wasser auf einem 1% Agarosegel (Roche) mit 1% Ethidiumbromid (2.5μl pro 100 ml Gel) für ein Pre-Screening gefärbt gemischt.
- Führen Sie das Gel für 1 Stunde bei 120 V, zusammen mit einem DNA-Längenstandard (BioRad EZ Last 100 bp-Leiter), mit einem Gel-Dokumentationssystem zu visualisieren. Sehen Sie ein Beispiel in Abbildung 1.
- Ausgewählte Proben mit amplifizierten Fragmente in der erwarteten Größe (zwischen 200 bp und 300 bp (Soll-Fragment ist 244 bp). Laden Sie das gesamte PCR-Reaktionsvolumen (davon 23μl ~ sind links) von diesen Kandidaten mit 6μl 5x Ladepuffer auf einem 2 % Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel und führen Sie für 2 Stunden.
- Legen Sie das Gel auf einem UV-Transilluminator (Bioblock Scientific) und per Augenschein. Sehen Sie ein Beispiel in Abbildung 2. Excise Banden der korrekten Größe von Gel mit einem Skalpell und in einzelne 1,5 ml Reaktionsgefäße gegeben. Purify Fragmente aus Gel, zum Beispiel mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research).
5. Sequenzierung und Identifizierung von PCR-Produkten
- Führen Sie Sanger-Sequenzierung des Ziels Fragmente, zum Beispiel auf einem ABI 3730 Kapillar-Sequenzer mit ABI Big Dye 3,1 Chemie (Applied Biosystems). Bereiten Sequenzierungen in 10 &mgr; l Volumen mit 10-20 ng gelgereinigt Vorlage cDNA, 1.75μl 5x Verdünnungspuffer, 0.5μl Big Dye V3.1 Premix, 1 ul Vorwärtsprimer (M52C 20, 10 mM) und ddH2O. Radfahren Bedingungen sind: 1 min initiale Denaturierung von 25 Zyklen gefolgt: 10 s bei 96 ° C, 5 s bei 45 ° C und 4 min bei 60 ° C. Purify und Vorbereitung der Sequenzierreaktion nach Ihren internen Protokolle.
- Identifizieren resultierenden cDNA-Sequenzen gegen Nukleotid-Datenbanken wie GenBank23, durch Web-basierte Tools wie BLAST am National Center for Biotechnology Information (NCBI, zB http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Repräsentative Ergebnisse:
Stockenten (Anas platyrhynchos) wurden bei Ottenby Bird Observatory im Dezember 2007 entnommen. Von jedem Stockente einer Probe auf FTA-Karte aufgenommen wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. Nach der Auslieferung waren die FTA-Karten in einem Gefrierschrank bei -20 ° C für zwei Jahre aufzubewahren. Das gleiche FTA-Karte Probe im Labor zu isolieren, Kraus et al getestet. 18 als positive Kontrolle, sowie neun verzehnfacht serielle Verdünnungen der es aufgenommen wurde. Zwei negative Kontrollen wurden i) Extraktion aus einer leeren FTA-Karte, um zu testen, ob es carry-over von der Puncher, und ii) RT-PCR-Reaktion, in der Nuclease freies Wasser als Vorlage verwendet wurde, zu testen, ob Kontaminationen aufgetreten, oder in Vorbereitung der PCR-Reaktion.
84 Proben wurden analysiert. Ein Gel Bild der PCR-Produkte von diesen 84 Proben sind in Abbildung 1 zu finden. Von natürlichen Proben eine Vielzahl von unspezifischen Banden können durch das Vorhandensein verschiedener mikrobieller Kontaminationen in den Kot beobachtet werden. Allerdings ist das Ziel Fragment des Primerpaar 244 bp lang. Die gesamte PCR-Reaktionsvolumen von einer Teilmenge der Proben, die Fragmente in etwa die richtige Größe (zwischen 200 bp und 300 bp) produziert wurde am Gel (Abbildung 1) geladen. Eine Darstellung, welche der Bands aus dem Gel ausgeschnitten wurden, können in Ergänzende Abbildung 1 entnommen werden. Neben der positiven Kontrolle wurden zwei dieser Proben (69899 und 69912) positive durch das neue Protokoll. Eine BLAST-Suche gegen die NCBI Nukleotid-Datenbank ergab, ihre Identität als AI-Matrix-Gen (Abbildung 3), während alle anderen Bands ähnlich bakteriellen Sequenzen am ehesten, oder haben nicht zu einem lesbaren Sequenz überhaupt.
Abbildung 1. Gel Bild von einer ersten Sichtung der PCR-Produkte. 2 ul PCR-Produkt der positiven Kontrolle, serial Verdünnungen der Positiv-Kontrolle, zwei negative Kontrollen und 84 cloacal Proben wurden geladen. 48 Proben sind in den Top-Gel-Panel, und 48 Proben im unteren Bereich angezeigt. Rote Pfeile zeigen Gelspuren für 100 bp DNA-Längenstandard verwendet. Zur Veranschaulichung zeigen rote Kreise Bands in der erwarteten Größenordnung. Blaue Kreise kennzeichnen eine unspezifische Amplifikat (oben links) oder einem Primer-Dimer Artefakt unterhalb von 100 bp in der Größe (unten rechts).
Abbildung 2. Die Auswahl der Proben mit Fragmente in der richtigen Größenordnung. Proben mit Banden zwischen 200 bp und 300 bp (Zielfragment 244 bp) wurden ausgewählt. Der grüne Pfeil zeigt die positive Kontrolle, zeigen die beiden roten Pfeile Proben, die bestätigt, dass AIV positive durch Vergleich ihrer cDNA-Sequenzen der NCBI Nukleotid-Datenbank.
Abbildung 3. Screen-Capture eines Vertreters BLAST-Suche bei NCBI. Einer der cDNA-Sequenzen aus dem herausgeschnittenen Fragmente erhalten wurde, gegen die Nukleotid-Datenbank der NCBI-Website abgefragt. Die Probe korrekt als AI-Matrix-Gen-Fragment identifiziert. Um die volle Größe Version dieses Bildes finden Sie hier.
Ergänzende Abbildung S1. Bands von ausgewählten Proben aus Gel ausgeschnitten. Dieses Bild aus dem Gel in Abbildung 1 nach Kandidaten Banden zwischen 200 bp und 300 bp dargestellt genommen wurde herausgeschnitten worden waren.
Discussion
Die hier beschriebene Protokoll stellt eine ergänzende Methode, um Fäkalien oder ähnlichen Proben auf das Vorhandensein von AIV Bildschirm. Es wurde speziell entwickelt, um die Probenentnahme schnell und einfach. Dies macht es möglich für weniger trainierte Personen, wie Jäger oder Wildtieren Manager, um AI-Überwachung beitragen. Keine Kühlketten angewendet werden müssen, obwohl das Einfrieren der Proben wird empfohlen, soweit möglich. Ein paar Tage bei Raumtemperatur, zum Beispiel während des Transports ins Labor, waren kein Problem für die RNA-Moleküle auf FTA-Karten, solange die Karten trocken blieb. Andere nicht gekühlt Storage-Systeme, die derzeit von der Forschungsgemeinschaft ausgewertet werden, wie Alkohol 15 oder Guanidin 16, erfordern besondere Vorkehrungen Versand wegen ihrer Gefährlichkeit. Im Gegensatz dazu wird die FTA-Karte-Verfahren nicht erforderlich, Versand von Gefahrgut. Allerdings ist ein weiteres interessantes Speichermedium in dieser Hinsicht RNAlater ™, ist nicht gefährlich, entweder 17. Beispiel Analyse kann in jedem Standard-molekularen Labor durchgeführt werden. Keine besondere Ausrüstung anders als für die üblichen PCR-Reaktionen und Kapillar-Sequenzierung wurde benötigt. Alle Schritte können ohne eine Sicherheitsstufe durchgeführt werden, da bereits bei der Probennahme die potenziellen Krankheitserregern durch die antibakterielle und antivirale Aktivität der FTA-Karte inaktiviert wurden.
Cross-Kontamination und anschließende falsch-positiven Proben wurden nicht in unsere Studien mit Wildvögeln Proben beobachtet. Doch bei der Arbeit mit RNA und PCR ist es immer ratsam, besondere Aufmerksamkeit zu schenken Arbeitsplätze und separate Räume für Pre-und Post-PCR-Schritte zu reinigen. Arbeiten in einem Abzug verringert das Risiko des Aerosol-Kontamination im Labor. Pipettieren muss mit Filterspitzen durchgeführt werden.
Von einer früheren Studie an Proben gleichzeitig über dieselbe Enten wissen wir, dass sechs der 84 Proben positiv waren von den traditionellen RealTime RT-PCR-Methode 24 und die CT-Werte von RealTime RT-PCR bekannt gemacht. Die beiden positiven Proben mit unserer Methode stammen von Enten, die Ct-Werte <30 (was auf eine hohe Konzentration von viraler RNA) aufgedeckt hatte. Die anderen vier Proben, die positiv mit dem traditionellen Protokoll waren, hatten Ct-Werte> 30 (weniger konzentriert) und nicht durch unser Protokoll erfasst werden.
Nur Proben mit relativ hoher Virustiter wurden in unserem Test positiv und es ist wahrscheinlich, dass die Empfindlichkeit des Verfahrens wird die Fehlerquelle zu allen positiven Proben nachzuweisen war. Ferner wurde die Stichprobengröße in der aktuellen Studie sehr gering und das Verfahren kann vollständig entwickelt und bewertet werden, wenn mehr kontrolliert und strenge Experimente durchgeführt werden. Allerdings, wenn diese Proben würden von einem abgelegenen Gebiet gesammelt worden sind, würde der traditionellen Analyse nicht möglich gewesen, zu haben. Darüber hinaus stammen diese ersten Ergebnisse aus Modellversuchen, die weitere Optimierung benötigen. Ein Zeitraum von zwei Jahren Lagerung in einem regelmäßigen -20 ° C Gefrierschrank nach Blutentnahme wahrscheinlich auch die Qualität der viralen RNA beeinflusst. Diese mögliche RNA-Abbaus ist ein wichtiges Thema beim Umgang mit Lagerung bei Raumtemperatur von inaktivierten Viren. Die Proben in alternative Flüssigkeiten gelagert, wie oben erwähnt leiden unter signifikanten Abbau der Analyse der längere Strecken des viralen Genoms 16 Auswirkungen. Obwohl in unserer Studie nicht getestet haben FTA-Karten nachweislich gut geeignet sein, um intakte RNA-Moleküle in anderen RNA-Systeme, die sehr ähnlich zu Avian Influenza-Viren 25, 26 sind erhalten.
Disclosures
Trapping, Handhabung und die Entnahme von Vögeln wurden folgende nationale Gesetzgebung getan und wurden von der schwedischen Zentralamt für Landwirtschaft und der Forschung Tier Ethikkommission genehmigt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Bert Dibbits für technische Unterstützung. Die Tierzucht und Genomics Group, Wageningen University, Niederlande, großzügig gehostet uns in ihrem Labor. Das Personal des Ottenby Bird Observatory, Schweden, ist zum Einfangen und Abtasten der Stockenten dankte, insbesondere Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson und Stina Andersson. Wir bedanken uns bei Sanne Svensson, Jonatan Qvist und Per-Axel Gjöres für die Dreharbeiten zu Ottenby und Mano Camon für Dreharbeiten in das Labor. Daniel Bengtson vorgesehen schöne Ente Fotos für das Video Teil dieser Publikation. Weitere freie Material aus dem CDC Public Health Image Library (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) verwendet wurde: Die elektronenmikroskopische Aufnahme (Nr. 280; von Dr. Erskine Palmer) und Illustration (Nr. 11823; von Douglas Jordan) des Influenza-Virus. Finanzielle Unterstützung wurde durch die KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), dem niederländischen Ministerium für Landwirtschaft, die Faunafonds und der Stichting de Eik Trusts (sowohl in den Niederlanden) angegeben, die schwedische Research Council (Grant No. 2007-20774) und der EG fundierte Newflubird Projekt. RNA-Isolierung Chemikalien wurden eine großzügige Schenkung von Ambion, Inc., die RNA-Unternehmen. Dies ist Beitrag Nr. 245 vom Ottenby Bird Observatory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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