Summary
Un método para preservar, detectar y secuencia de ARN del virus de la gripe aviar fue confirmada y ampliada usando colorantes naturales como muestras de heces de las aves. Esta técnica elimina la necesidad de mantener una cadena de frío y la manipulación de virus infecciosos y puede ser aplicado en un 96-así de alto rendimiento de la instalación.
Abstract
Virus de influenza aviar (AIVs) infectan a muchos mamíferos, incluyendo seres humanos 1. Estos AIVs son diversos en sus huéspedes naturales, albergando casi todos los posibles subtipos virales 2. Pandemias de gripe humana originalmente provienen de AIVs 3. Muchos de los casos fatales humanos durante los brotes de H5N1 en los últimos años se registraron. Últimamente, una nueva cepa relacionada con AIV se extendió por la población humana, causando cuatro de la 'epidemia de gripe porcina ". Aunque el comercio y la actividad humana de transporte parece ser responsable de la propagación de cepas de alta patogenicidad 5, la dispersión puede ser atribuida en parte a las aves silvestres 6, 7. Sin embargo, el depósito real de todas las cepas de VIA son las aves silvestres.
En reacción a esto y frente a graves pérdidas comerciales en la industria de aves de corral, los grandes programas de vigilancia se han aplicado a nivel mundial para reunir información sobre la ecología de AIVs, y la instalación de sistemas de alerta temprana para detectar ciertas cepas altamente patógenas 08.12. Los métodos tradicionales requieren virológica virus que está intacta y cultivadas antes del análisis. Para ello se requiere estricta cadena de frío con congeladores y pesados procedimientos de bioseguridad para estar en su lugar durante el transporte. Vigilancia a largo plazo es por lo tanto, generalmente se limita a una pocas estaciones de campo cerca de laboratorios bien equipados. Zonas remotas que no pueden ser degustados a menos que los procedimientos de logística complicado su aplicación. Estos problemas han sido reconocidos 13, 14 y el uso de almacenamiento y estrategias alternativas de transporte investigado (alcoholes o guanidina) 15-17. Recientemente, Kraus et al. 18 introdujo un método para recopilar, almacenar y transportar las muestras de VIA, basada en un papel filtro especial. 19 tarjetas FTA preservar el ARN en una base de almacenamiento en seco 20 y hacer que los agentes patógenos inactiva al entrar en contacto 21. Este estudio mostró que las tarjetas de FTA puede ser utilizado para detectar AIV ARN en la PCR con transcripción inversa y que el ADNc resultante podría ser secuenciado los genes del virus y determina.
En el estudio de Kraus et al. 18 un laboratorio aislado del AIV se utilizó, y las muestras fueron manejadas de forma individual. En la extensión que aquí se presenta, muestras de heces de las aves silvestres de la trampa de pato en el Observatorio de Aves Ottenby (SE Suecia) se pusieron a prueba directamente para ilustrar la utilidad de los métodos en condiciones de campo. La captura de los patos y la recogida de muestras de hisopos cloacales se demuestra. El protocolo actual incluye aumento de escala del flujo de trabajo de la manipulación de un solo tubo con un diseño de 96 pozos. Aunque es menos sensible que los métodos tradicionales, el método de tarjetas FTA proporciona un excelente complemento a los sistemas de vigilancia de gran tamaño. Se permite la recolección y análisis de muestras de cualquier parte del mundo, sin la necesidad de mantener una cadena de frío o de las normas de seguridad con respecto al envío de reactivos peligrosos, como el alcohol o guanidina.
Protocol
1. Pato trampas y Frotar la cloaca
- Trampa escarceos patos del género Anas (u otras aves) en una jaula por atraerlos con patos señuelo o alimentos, y ponerlos en cajas individuales de cartón. El tiempo de transporte en la caja debe ser reducido al mínimo, por ejemplo, mediante la instalación de una estación de campo a corta distancia a la trampa. Circunstancias logística puede variar en cada estudio. El consejo y la aprobación del correspondiente comité de ética de los animales debe ser buscada por cada nuevo set-up. Por otra parte, también cazador de aves cazadas pueden ser degustados.
- Saque el pato de la caja mediante la celebración de sus alas apretado a su cuerpo. Muestra una caída fresco, que estará presente en la mayoría de los casos, directamente desde la parte inferior de la caja. Recogerlos con una gasa estéril y aplique el líquido a una tarjeta de Whatman FTA. Si no es así, lleve a cabo hisopado cloacal.
- A su vez el pato en la espalda. Esto permite el acceso a la cloaca y facilita la toma de muestras. La cloaca es una estructura que sobresale situado por debajo del abdomen, cerca de la base de la cola. Una persona con experiencia podía contener y la muestra de aves, al mismo tiempo, o bien una segunda persona puede ayudar.
- Inserte cuidadosamente el hisopo estéril de plástico rayón (Copan, Italia), aproximadamente 1 cm y hacer un remolino suave de la cloaca. Rodar el hisopo con los fluidos de la cloaca en la superficie de una tarjeta de Whatman FTA. Después del muestreo se ha realizado liberación inmediata de los animales es deseable.
- Seca las tarjetas de FTA a temperatura ambiente durante al menos 1 hora, a continuación, almacenar cada muestra individual en bolsas de papel (sobres, por ejemplo). El almacenamiento es posible a temperatura ambiente, posiblemente con perlas de sílice en climas húmedos. El envío y recepción de los oficiales instituciones de bioseguridad puede permitir enviar tarjetas de TLC por correo ordinario, ya que los patógenos se vuelven inactivos al entrar en contacto con la superficie de la tarjeta FTA.
2. El aislamiento de ARN viral
- Extraer el material de la tarjeta FTA incluidas las heces / líquido cloacal. Perfore tres discos con un golpeador mm Harris 2 y el lugar a todos aquellos dentro de un pozo de una placa de RNasa libre 96well. Entre cada muestra nueva, limpia cuidadosamente el golpeador con el alcohol y una precisión Kim limpiar (KIMTECH). Siempre use los controles positivos y negativos. Un control positivo puede consistir en una cepa de laboratorio recién aplicado a una tarjeta de libre comercio, o una muestra natural que se sabe que un resultado positivo. Como control negativo, ponche a cabo los discos de un acuerdo de libre comercio para tarjetas vacía. Además, dejar a otro, así libre para un control PCR después de su experiencia (con el agua como plantilla).
- Añadir 70μl de solución de extracción rápida del ARN (Ambion) y el calor de sellado de la placa (AbGene Thermo-Sellador). Incubar 5 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente con la velocidad determinada que no causa desbordamiento (esto depende de la placa, que modelo de agitador; prueba de antemano).
- Realizar aislamiento viral ARN de acuerdo con los protocolos del fabricante con el MagMAX-96 aislamiento de ARN viral kit (Ambion). En resumen: Agregar 130μl preparado lisis / vinculante solución (del kit) a cada pocillo. Transferencia de material extraído 50μl TLC tarjeta a cada pocillo. Agitar la placa durante 1 minuto.
- Añadir 20μl mezcla preparada de cuentas (del kit) a cada muestra y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Agitar en velocidad determinada durante 5 minutos. Las moléculas de ARN se unirá a las perlas magnéticas.
- Mover la placa de un campo magnético de 96 pozos de pie para capturar las bolas. Dependiendo del modelo de soporte magnético utilizado, esto puede tomar más de 5 minutos. Cuando la solución se ha vuelto completamente claro, retirar y desechar el sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético.
- Lave las cuentas dos veces con solución de lavado 1 y dos veces con solución de lavado 2 (del kit). Para cada uno de los cuatro pasos de lavado añadir 150μl solución de lavado preparado para cada muestra, agitar durante 1 minuto a velocidad determinada, mover la placa en el soporte magnético, la captura de cuentas por unos 5 minutos (o hasta que la solución está del todo claro), y eliminar descartar el sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético, añadir la solución de limpieza que viene, y llevar a cabo los pasos de lavado como antes. Después de la etapa de lavado último, eliminar la solución de lavado tanto como sea posible y deje secar los granos a temperatura ambiente en el agitador de placas durante 2 minutos.
- Añadir 50μl de tampón de elución (del kit) para liberar el ARN de las cuentas y agitar durante 4 minutos en el agitador de placas. Captura de cuentas como se describió anteriormente. El sobrenadante contiene ahora el ARN aislado que está listo para aplicaciones posteriores.
3. RT-PCR del gen de la AIV Matrix
Llevar a cabo la PCR con transcripción inversa (RT-PCR) con el acceso de un solo paso RT-PCR System (Promega) en 25 reacciones l (adaptado de Kraus et al 18 y Fouchier et al 22..):
| Nucleasa agua libre | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 buffer 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| imprimación M52C 22 (10 M) | 2.5μl |
| imprimación M253R 22 (10 M) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| AMV de la transcriptasa inversa (5u/μl) | 0.5μl |
| Tfl polimerasa (5u/μl) | 0.5μl |
| ARN de la muestra | 5μl |
Las condiciones de PCR en un termociclador Biometra T1 son: la transcripción inversa inicial de 45 minutos a 45 ° C, seguido de 2 minutos de desnaturalización a 94 ° C y 40 ciclos de: 94 ° C durante 1 minuto, 56 ° C durante 1 minuto, y 68 ° C durante 2 minutos. Una elongación adicional de 7 minutos a 68 ° C llega a la conclusión de la amplificación.
4. La detección de muestras positivas a influenza aviar y la purificación de fragmentos orientado de Gel
- Carga 2μl del producto de PCR se mezcla con tinte 2μl carga 5x (BioRad) y agua 6μl en un 1% en gel de agarosa (Roche) teñido con bromuro de etidio al 1% (2.5μl por cada 100 ml de gel) para una pre-evaluación.
- Dejar correr el gel durante 1 hora a 120, junto con un tamaño estándar de ADN (BioRad carga EZ escalera de 100 pb), visualizar con un sistema de documentación de geles. Vea un ejemplo en la Figura 1.
- Seleccionar las muestras con los fragmentos amplificados en el rango de tamaño esperado (entre 200 pb y 300 pb (fragmento diana es de 244 pb). Cargue el volumen total de reacción de PCR (de los cuales se dejan ~ 23μl) de estos candidatos con el tinte 6μl carga 5x en un 2 bromuro de etidio manchadas% en gel de agarosa y una duración de 2 horas.
- Colocar el gel en un transiluminador UV (Bioblock Científicas) y una inspección visual. Vea un ejemplo en la figura 2. Las bandas de los impuestos especiales de la talla correcta de gel con un bisturí y se coloca en tubos de 1,5 ml cada reacción. Purificar fragmentos de gel, por ejemplo, con la recuperación Zymoclean Gel de ADN Kit (Zymo de Investigación).
5. Secuenciación e Identificación de los productos PCR
- Llevar a cabo la secuenciación de Sanger de los fragmentos de destino, por ejemplo en un ABI 3730 secuenciador capilar ABI Big Dye con 3,1 química (Applied Biosystems). Preparar la secuencia de reacciones en los volúmenes de 10μl conteniendo 10-20 ng gel purificado plantilla de cDNA de amortiguamiento, 1.75μl dilución de 5x, gran 0.5μl premezcla tinte V3.1, una imprimación l hacia delante (M52C 20, 10 mM), y ddH2O. Ciclismo condiciones son: 1 min de desnaturalización inicial, seguido por 25 ciclos de: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C y 4 minutos a 60 º C. Purificar y preparar la reacción de secuenciación de acuerdo a sus protocolos internos.
- Identificar las secuencias de ADNc resultante con bases de datos de nucleótidos, como GenBank23, por ejemplo, de las herramientas con tales como BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Los resultados representativos:
Ánade real (Anas platyrhynchos) fueron muestreados a Ottenby Observatorio de Aves en diciembre de 2007. De cada uno de ánade real de una muestra en la tarjeta FTA fue tomada como se describe en este protocolo. Después del envío, las tarjetas de FTA se mantuvieron en un congelador a -20 ° C durante dos años. La misma muestra TLC tarjeta del laboratorio examinado de manera aislada en Kraus et al. 18 se incluyó como control positivo, así como nueve diluciones seriadas diez veces de la misma. Dos controles negativos fueron i) la extracción de una tarjeta vacía de libre comercio, para comprobar si hubo traspaso de la perforadora, y ii) RT-PCR reacción en la que se utilizó agua libre de nucleasa como plantilla, para poner a prueba si la contaminación se produjo durante o en la preparación de la reacción de PCR.
84 muestras fueron analizadas. Una imagen del gel de los productos PCR de estas 84 muestras se pueden encontrar en la figura 1. A partir de muestras naturales de una multitud de bandas inespecíficas se pueden observar debido a la presencia de contaminaciones microbianas diversas en las heces. Sin embargo, el fragmento diana del primer par es de 244 pb. Toda la reacción PCR volumen de un subconjunto de las muestras que produjeron fragmentos de aproximadamente el rango de tamaño adecuado (entre 200 pb y 300 pb) fue cargado en gel (Figura 1). Un ejemplo de que una de las bandas se cortaron del gel se puede encontrar en la figura de apoyo 1. Además de los controles positivos, dos de estas muestras (69.899 y 69.912) fueron positivas por el nuevo protocolo. Una explosión de búsqueda contra la base de datos NCBI de nucleótidos reveló su identidad como AI matriz de genes (Figura 3), mientras que todas las otras bandas parecía secuencias bacterianas más de cerca, o no producir una secuencia legible en todo.
Figura 1. Gel imagen de una selección preliminar de los productos de PCR. 2 l producto de PCR del control positivo, sdiluciones erial del control positivo, dos controles negativos y 84 muestras cloacales fueron cargados. 48 muestras se muestran en el panel de gel superior, y las muestras de 48 en el panel inferior. Las flechas rojas indican carriles de gel que se utiliza para 100 pares de bases del ADN de tamaño estándar. A título de ejemplo, los círculos rojos indican las bandas en el rango de tamaño esperado. Los círculos azules indican una amplificación inespecífica (arriba a la izquierda) o un artefacto dímero imprimación debajo de 100 pb de tamaño (inferior derecha).
Figura 2. Las muestras de selección de muestras con los fragmentos en el rango de tamaño correcto. Con bandas de 200 pb y 300 pb (244 pb objetivo fragmento) fueron elegidos. La flecha verde indica que el control positivo, las dos flechas rojas indican las muestras que fueron confirmados como positivos AIV mediante la comparación de sus secuencias de cDNA de la base de datos NCBI de nucleótidos.
Figura 3. Captura de pantalla de una búsqueda BLAST en el NCBI representante. Una de las secuencias de ADNc obtenidas a partir de los fragmentos extirpados fue consultada la base de datos de nucleótidos en el sitio web de NCBI. La muestra está correctamente identificado como fragmento de gen AI Matrix. Para ver la versión completa de esta imagen, haga clic aquí.
Figura S1. Bandas de muestras seleccionadas extirpados de gel. Esta foto fue tomada a partir del gel se muestra en la Figura 1, después de bandas candidatas entre los 200 pb y 300 pb fueron cortadas.
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona un método complementario a la pantalla de muestras fecales o similar para la presencia de VIA. Fue diseñado especialmente para la recogida de muestras rápido y fácil. Esto hace posible que las personas menos entrenadas, como cazadores o gestores de la vida silvestre, para contribuir a la vigilancia de la AI. Nada de cadenas de frío se deben aplicar, a pesar de la congelación de las muestras, se recomienda siempre que sea posible. A los pocos días de la temperatura ambiente, por ejemplo durante el transporte al laboratorio, no fueron un problema para las moléculas de ARN en las tarjetas de TLC, siempre y cuando las tarjetas se mantuvo seco. Otros no refrigerados los sistemas de almacenamiento que se están evaluando por la comunidad científica, como el alcohol de 15 o 16 de guanidina, requieren un régimen especial de envío debido a su naturaleza peligrosa. En contraste, el método de la tarjeta TLC no requieren el envío de materiales peligrosos. Sin embargo, otro medio de almacenamiento interesante a este respecto es RNAlater ™ que no es peligroso, ya sea 17. Análisis de la muestra se puede realizar en cualquier laboratorio molecular estándar. No requiere equipo especial que no sea para siempre las reacciones de PCR y secuenciación capilar que se necesitaba. Todas las medidas que podrían llevarse a cabo sin un nivel de bioseguridad, porque ya en la recogida de muestras, los agentes patógenos potenciales fueron desactivados por la actividad antibacteriana y antiviral de la tarjeta FTA.
La contaminación cruzada de muestras y posterior de falsos positivos no se han observado en nuestras pruebas con muestras de aves silvestres. Sin embargo, cuando se trabaja con RNA y PCR siempre es recomendable prestar especial atención a los lugares de trabajo limpios y las habitaciones separadas para los pasos de pre-y post-PCR. Trabajar en una campana de extracción, disminuye el riesgo de contaminación de aerosoles en el laboratorio. Pipeteo debe llevarse a cabo con puntas con filtro.
De un estudio previo de las muestras tomadas al mismo tiempo de los patos mismo sabemos que seis de las 84 muestras fueron positivas por el tiempo real tradicional método RT-PCR 24 y los valores de Ct de tiempo real RT-PCR se conocen. Las dos muestras positivas detectadas por nuestro método de madre de los patos que tenían valores de Ct <30 (que indica una alta concentración de ARN viral). Las otras cuatro muestras que dieron positivo con el protocolo tradicional tenían valores de Ct> 30 (menor concentración) y no pudo ser detectada por el protocolo.
Sólo las muestras con títulos de virus relativamente altos fueron positivos en nuestro ensayo, y es probable que la sensibilidad del método fue el origen de la imposibilidad de detectar todas las muestras positivas. Además, el tamaño de la muestra en el estudio era muy baja y el método puede ser completamente desarrollado y evaluado si los experimentos más controlada y rigurosa se llevan a cabo. Sin embargo, si estas muestras se han recogido de una zona remota, el análisis tradicional no habría sido posible en absoluto. Además, estos primeros resultados se derivan de las experiencias piloto que se necesita una mayor optimización. Un período de dos años de almacenamiento en un congelador a -20 ° regulares C después de la toma de muestras, probablemente también se ve afectada la calidad del ARN viral. Que esto sea posible la degradación del ARN es un tema importante cuando se trata de guardar a temperatura ambiente de virus inactivados. Las muestras almacenadas en los líquidos alternativos como se mencionó anteriormente sufren de una degradación significativa que afecta el análisis de los tramos más largos del genoma viral 16. Aunque no han sido evaluados en nuestro estudio, las tarjetas de FTA han demostrado ser muy adecuado para conservar intactas las moléculas de ARN en otros sistemas de ARN que son muy similares a los virus de la gripe aviar 25, 26.
Disclosures
Captura, manejo y toma de muestras de aves se realiza siguiendo la legislación nacional y fueron aprobados por el Consejo de Agricultura de Suecia y el comité de ética de la investigación de los animales.
Acknowledgments
Damos las gracias a Bert Dibbits de asistencia técnica. La cría de animales y Grupo de Genómica, la Universidad de Wageningen, Países Bajos, generosamente nos acogió en su laboratorio. El personal del Observatorio Ottenby Bird, Suecia, se agradece trampeo y muestreo del ánade real, en particular, Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Magnusson y Christopher Andersson Stina. Damos las gracias a Sanne Svensson, Qvist Jonatan y Per-Axel Gjöres para el rodaje en Ottenby, y Camón Mano para la filmación en el laboratorio. Daniel siempre Bengtson bellas fotografías de pato para la parte de vídeo de esta publicación. Más material libre de la Biblioteca Pública de los CDC de la imagen de la Salud (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) se utilizó: El microscopio electrónico (n º 280, por el Dr. Erskine Palmer) e ilustración (n º 11823; por Douglas Jordania) del virus de la influenza. El apoyo financiero fue dada por el KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), el Ministerio holandés de Agricultura, Faunafonds y la Stichting de Fideicomisos Eik (tanto en los Países Bajos), el Consejo Sueco de Investigación (concesión no. 2.007-20.774) y la CE fundada Newflubird proyecto. Productos químicos de aislamiento de ARN fueron un generoso regalo de Ambion, Inc, la compañía de ARN. Esta es la contribución N º 245, del Observatorio de Aves Ottenby.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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