Summary
Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell'influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.
Abstract
I virus dell'influenza aviaria (AIVs) infettare molti mammiferi, compresi gli esseri umani 1. Queste AIVs sono diversi nei loro ospiti naturali, l'ospitare quasi tutti i possibili sottotipi virali 2. Pandemie influenzali umani di origine derivano da AIVs 3. Molti casi mortali umani durante la focolai di H5N1 negli ultimi anni sono stati segnalati. Ultimamente, un nuovo ceppo AIV relativi attraversò la popolazione umana, causando 4 il 'epidemia di influenza suina'. Anche se di trading e dell'attività umana trasporto sembra essere responsabile della diffusione di ceppi altamente patogeni 5, la dispersione può anche essere in parte attribuito a uccelli selvatici 6, 7. Tuttavia, la riserva reale di tutti i ceppi AIV è uccelli selvatici.
In reazione a questo e di fronte alle gravi perdite commerciali nel settore del pollame, i programmi di sorveglianza di grandi dimensioni sono stati implementati a livello globale per raccogliere informazioni sull'ecologia di AIVs, e di installare sistemi di allarme rapido per rilevare alcuni ceppi altamente patogeni 8-12. I metodi tradizionali di virus virologica richiedono di essere integro e coltivato prima dell'analisi. Ciò richiede rigorosa catena del freddo con congelatori e pesanti le procedure di biosicurezza essere a posto durante il trasporto. A lungo termine di sorveglianza è quindi di solito limitata ad una delle stazioni di campo di alcuni stretti ai laboratori ben attrezzati. Aree remote non possono essere oggetto di campionamento a meno che le procedure logisticamente complicato l'attuazione. Questi problemi sono stati riconosciuti 13, 14 e l'utilizzo dello stoccaggio e strategie alternative di trasporto indagato (alcoli o guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 ha introdotto un metodo per raccogliere, immagazzinare e trasportare campioni di AIV, basato su una carta speciale filtro. FTA 19 carte preservare l'RNA su una base di stoccaggio a secco 20 e rendere inattivi gli agenti patogeni a contatto 21. Questo studio ha dimostrato che le carte FTA può essere utilizzato per rilevare AIV RNA in PCR di trascrizione inversa e che il cDNA risultante potrebbe essere sequenziato i geni del virus e determinato.
Nello studio di Kraus et al. 18 un laboratorio isolato di AIV è stato utilizzato, ei campioni sono stati trattati singolarmente. Nella estensione qui presentata, campioni di feci di volatili selvatici dalla trappola d'anatra al Uccello Ottenby Observatory (SE Svezia) sono stati testati direttamente per illustrare l'utilità dei metodi in condizioni reali. Cattura di anatre e raccolta dei campioni da tamponi cloacali è dimostrata. Il protocollo attuale prevede up-scaling del flusso di lavoro dalla gestione singolo tubo di un design a 96 pozzetti. Anche se meno sensibili rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di FTA carte offre un ottimo complemento ai sistemi di sorveglianza di grandi dimensioni. Esso consente la raccolta e l'analisi di campioni provenienti da ogni parte del mondo, senza la necessità di mantenimento di una catena fredda o norme di sicurezza rispetto alla spedizione di reagenti pericolosi, come l'alcool o guanidina.
Protocol
1. Anatra trapping e tamponamento cloacali
- Trappola dabbling anatre del genere Anas (o di altri volatili) in una gabbia di attirarli con le anatre esca o cibo, e metterli in scatole di cartone individuale. Tempo di trasporto nella scatola dovrebbe essere ridotto al minimo, per esempio, con l'installazione di una stazione di campo a breve distanza per la trappola. Circostanze logistiche possono variare in ogni studio. La consulenza e l'approvazione del relativo animale comitato etico deve essere ricercata per ogni nuovo set-up. In alternativa, anche cacciatore di uccelli abbattuti si possono degustare.
- Estrarre il anatra della scatola tenendo le ali stretto al suo corpo. Esempio di un dropping fresca, che sarà presente nella maggior parte dei casi, direttamente dalla parte inferiore della scatola. Raccoglierli con un tampone sterile e applicare il liquido ad una carta Whatman FTA. In caso contrario, eseguire tampone cloacale.
- Accendere l'anatra sulla sua schiena. Questo consente l'accesso alla cloaca e facilita campionamento. La cloaca è una struttura sporgente situata sotto l'addome, vicino alla base della coda. Una persona con esperienza poteva contenere l'uccello e il campione, allo stesso tempo, oppure una seconda persona può aiutare.
- Inserire con cautela il tampone sterile in plastica rayon (Copan, Italia) circa 1 cm e fare un dolce vortice della cloaca. Rotolare il tampone con i fluidi dalla cloaca sulla superficie di una carta Whatman FTA. Dopo il campionamento è stato effettuato l'immediato rilascio degli animali è auspicabile.
- Asciugare le carte FTA a temperatura ambiente per almeno 1 ora, quindi archiviare ogni campione singolarmente in sacchetti di carta (es. buste). Lo storage è possibile a temperatura ambiente, possibilmente con perline di silice nei climi umidi. L'invio e la ricezione di biosicurezza istituzioni ufficiali 'può permettere di mandare le carte accordo di libero scambio per posta ordinaria, dal momento che i patogeni diventano inattivi a contatto con la superficie della carta FTA.
2. Isolamento di RNA virale
- Estrarre il materiale carta FTA tra cui feci / fluido cloaca. Punch tre dischi con un perforatore 2 millimetri Harris e luogo tutti coloro in un pozzo di una piastra di RNasi libero 96well. Tra ogni nuovo campione, pulire accuratamente il nemico con l'alcol e una precisione Kim wipe (Kimtech). Usare sempre controlli positivi e negativi. Un controllo positivo può essere costituito da un ceppo di laboratorio appena applicato a una carta di accordo di libero scambio o di un campione naturale che è conosciuto per produrre un risultato positivo. Come controllo negativo, punch out dischi da una scheda vuota FTA. Inoltre, lasciare libero un altro pozzo per un controllo PCR dopo nel tuo esperimento (con l'acqua come modello).
- Aggiungere 70μl RNA soluzione di estrazione rapida (Ambion) e termosaldato la piastra (AbGene Thermo-Sealer). Incubare 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente con la velocità stabilito che non provoca spill-over (questo dipende dal modello di piastra utilizzata shaker; test in anticipo).
- Carry isolamento virale RNA secondo protocolli del produttore con il MagMAX-96 Kit di isolamento virale RNA (Ambion). In breve: Aggiungere 130μl preparato lisi / soluzione vincolante (dal kit) in ogni pozzetto. Trasferire 50μl estratto materiale carta FTA in ciascun pozzetto. Agitare piastra per 1 minuto.
- Aggiungere 20μl miscela preparata tallone (dal kit) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù. Agitare sulla velocità determinato per 5 minuti. Molecole di RNA si legano al sfere magnetiche.
- Spostare la piastra ad una magnetica a 96 pozzetti stand per catturare le sfere. A seconda del modello di supporto magnetico utilizzato, questo può richiedere più di 5 minuti. Quando la soluzione si è rivelata del tutto chiare, rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la piastra dal supporto magnetico.
- Lavare le perle due volte con la soluzione di lavaggio 1 e due volte con soluzione di lavaggio 2 (dal kit). Per ognuna delle 4 fasi di lavaggio aggiungere 150μl soluzione preparata di lavaggio per ogni campione, agitare per 1 minuto a velocità determinata, spostare il piatto per il supporto magnetico, la cattura perline per circa 5 minuti (o fino a quando la soluzione è del tutto chiaro), rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la placca dalla base magnetica, aggiungere la soluzione successiva lavaggio, ed eseguire le fasi di lavaggio come in precedenza. Dopo la fase di lavaggio scorso, rimuovere soluzione di lavaggio per quanto possibile, e aria secca le perline a temperatura ambiente nello shaker piastra per 2 minuti.
- Aggiungere 50μl di tampone di eluizione (dal kit) per liberare l'RNA dalle perline e agitare per 4 minuti in agitatore. Cattura perle come descritto in precedenza. Il supernatante ora contiene l'RNA isolato che è pronta per le applicazioni a valle.
3. RT-PCR di Matrix AIV Gene
Effettuare PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) con l'accesso di uno stadio di RT-PCR system (Promega) in 25 microlitri reazioni (regolato da Kraus et al 18 e Fouchier et al 22..):
| Acqua priva di nucleasi | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 tampone 5μl | |
| dNTP | 0.5μl |
| Primer M52C 22 (10 mM) | 2.5μl |
| Primer M253R 22 (10 mM) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| AMV della trascrittasi inversa (5u/μl) | 0.5μl |
| Polimerasi TfL (5u/μl) | 0.5μl |
| RNA campione | 5μl |
Condizioni di PCR in un T1 Biometra termociclatore sono: la trascrizione inversa iniziale di 45 minuti a 45 ° C, seguito da 2 minuti denaturazione iniziale a 94 ° C e 40 cicli di: 94 ° C per 1 minuto, 56 ° C per 1 minuto, e 68 ° C per 2 minuti. Un allungamento altri 7 minuti a 68 ° C si conclude l'amplificazione.
4. Screening per AI-I campioni positivi e Purificazione di frammenti mirate da Gel
- 2μl carico del prodotto della PCR mescolato con 2μl colorante carico 5x (BioRad) e l'acqua 6μl su un 1% gel (Roche) colorato con bromuro di etidio 1% (2.5μl per 100 ml di gel) per un pre-screening.
- Esegui il gel per 1 ora a 120V, con un formato standard di DNA (BioRad carico EZ 100 bp ladder), visualizzare con un sistema di documentazione del gel. Vedere un esempio in Figura 1.
- Selezionare i campioni con frammenti amplificati nella gamma di dimensioni previste (tra 200 bp e 300 bp (frammento obiettivo è di 244 bp). Carico l'intero volume di reazione di PCR (di cui ~ 23μl sono a sinistra) di questi candidati con 6μl colorante carico 5x su un 2 etidio bromuro% gel colorato e correre per 2 ore.
- Posizionare il gel su un transilluminatore UV (Bioblock scientifico) e ispezionato visivamente. Vedere un esempio in Figura 2. Bande di accisa di dimensioni corrette da gel con un bisturi e posto in provette 1,5 ml individuali di reazione. Purificare frammenti di gel, per esempio con il Zymoclean Recovery Kit DNA Gel (Zymo Ricerca).
5. Sequenziamento ed identificazione dei prodotti PCR
- Effettuare Sanger sequenziamento dei frammenti di destinazione, ad esempio su un sequenziatore ABI 3730 capillare con ABI Big Dye 3,1 chimica (Applied Biosystems). Preparare reazioni di sequenziamento dei volumi 10μl contenente 10-20 ng gel purificato modello cDNA, buffer 1.75μl diluizione 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, 1 fondo microlitri avanti (M52C 20, 10 mm) e ddH2O. Condizioni di ciclismo sono: 1 min denaturazione iniziale, seguita da 25 cicli di: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C e 4 minuti a 60 ° C. Purificare e preparare la reazione di sequenziamento secondo i protocolli interni.
- Identificare sequenze di cDNA risultante nei database nucleotidici come GenBank23, ad esempio strumenti web based come BLAST presso il Centro Nazionale for Biotechnology Information (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Rappresentante dei risultati:
Germano reale (Anas platyrhynchos) sono state campionate in Ottenby Bird Observatory nel dicembre 2007. Da ogni germano reale su un campione FTA scheda è stato preso come descritto in questo protocollo. Dopo la spedizione, le carte FTA sono stati tenuti in un congelatore a -20 ° C per due anni. Lo stesso campione di carta FTA del laboratorio di isolare testato in Kraus et al. 18 è stato incluso come controllo positivo, così come nove dieci volte diluizioni seriali di esso. Due sono stati i controlli negativi) l'estrazione da una scheda vuota accordo di libero scambio, per verificare se ci fosse riporto dal perforatore, e ii) RT-PCR, reazione in cui è stato utilizzato nucleasi acqua libera, come modello, per verificare se la contaminazione si è verificato durante o in preparazione della reazione PCR.
84 campioni sono stati analizzati. Una foto gel dei prodotti di PCR da questi 84 campioni possono essere trovati nella Figura 1. Da campioni naturali una moltitudine di bande non specifiche può essere osservato a causa della presenza di contaminazioni microbiche diverse nelle feci. Tuttavia, il frammento di destinazione della coppia di primer è di 244 bp lungo. L'intera reazione PCR volume di un sottoinsieme dei campioni che hanno prodotto frammenti in circa la gamma di dimensioni corrette (tra 200 bp e 300 bp) è stato caricato su gel (Figura 1). Un esempio di quale delle bande sono state tagliate dal gel si possono trovare nella figura di complemento 1. In aggiunta al controllo positivo, due di questi campioni (69.899 e 69.912) sono risultati positivi dal nuovo protocollo. Una ricerca BLAST contro il database NCBI nucleotide rivelato la loro identità di AI matrice gene (Figura 3), mentre tutte le altre band assomigliava sequenze batteriche più da vicino, o non producono una sequenza leggibile a tutti.
Figura 1. Immagine gel di uno screening preliminare dei prodotti di PCR. Microlitri 2 prodotto PCR di controllo positivo, sdiluizioni erial del controllo positivo, due controlli negativi e 84 campioni cloacali sono stati caricati. 48 campioni sono mostrati nel pannello in alto gel, e 48 campioni nel pannello inferiore. Frecce rosse indicano corsie gel utilizzato per 100 bp DNA di dimensioni standard. Per esempio, cerchi rossi mostrano bande nel range dimensioni previste. Cerchi blu indicano un amplicone aspecifica (in alto a sinistra) o di un manufatto dimero iniettore di sotto di 100 bp nel formato (in basso a destra).
Figura 2. Selezione dei campioni con frammenti nell'intervallo di grandezza corretto. Campioni con bande tra 200 bp e 300 bp (target frammento di 244 bp) sono stati scelti. La freccia verde indica il controllo positivo, le due frecce rosse indicano i campioni che sono stati confermati da AIV positiva mettendo a confronto le loro sequenze cDNA al database NCBI nucleotide.
Figura 3. Cattura dello schermo di una ricerca BLAST rappresentante NCBI. Una delle sequenze cDNA ottenuto dai frammenti asportati è stato interrogato sul database nucleotide sul sito NCBI. Il campione viene correttamente identificate come frammento AI gene Matrix. Per visualizzare la versione completa di dimensioni di questa immagine, clicca qui.
Supplementare Figura S1. Bande di campioni selezionati escisse dal gel. Questa foto è stata scattata dal gel rappresentato in figura 1, dopo le bande candidato tra 200 bp e 300 bp sono stati tagliati fuori.
Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo supplementare per lo screening dei campioni fecali o simili per la presenza di AIV. E 'stato appositamente studiato per rendere la raccolta del campione rapido e facile. Questo rende possibile per le persone meno allenati, come cacciatori o gestori della fauna selvatica, per contribuire alla sorveglianza AI. Nessuna catena fresco devono essere applicate, anche se il congelamento dei campioni è consigliabile, ove possibile. Pochi giorni di temperatura ambiente, per esempio durante il trasporto al laboratorio, non erano un problema per le molecole di RNA su schede FTA, fino a quando le carte sono rimasti a secco. Altri non raffreddato sistemi di storage che sono attualmente valutati dalla comunità di ricerca, come l'alcool 15 o guanidina 16, richiedono particolari modalità di spedizione a causa della loro natura pericolosa. Al contrario, il metodo della carta FTA non richiede spedizione di materiali pericolosi. Tuttavia, un altro supporto di memorizzazione interessante a questo riguardo è RNAlater ™ che non è pericoloso, sia 17. Analisi dei campioni può essere effettuata in qualsiasi standard di laboratorio molecolare. Nessuna attrezzatura speciale diverso dal solito per reazioni di PCR e il sequenziamento capillare era necessario. Tutte le fasi potrebbe essere effettuata senza un livello di biosicurezza perché già al momento della raccolta dei campioni di agenti patogeni potenziali sono stati inattivati dalla attività antibatterica e antivirale della carta FTA.
Contaminazione incrociata e successive campioni falsi positivi non sono stati osservati nelle nostre prove con campioni di uccelli selvatici. Tuttavia, quando si lavora con l'RNA e PCR è sempre consigliabile prestare particolare attenzione per la pulizia dei luoghi di lavoro e stanze separate per le fasi pre-e post-PCR. Lavorare in una cappa aspirante diminuisce il rischio di contaminazione da aerosol in laboratorio. Pipettaggio deve essere effettuata con puntali con filtro.
Da uno studio precedente su campioni prelevati simultaneamente dal anatre stessa sappiamo che sei dei 84 campioni sono risultati positivi con il tradizionale RealTime RT-PCR 24 e i valori di Ct da RealTime RT-PCR sono noti. I due campioni positivi rilevati dal nostro staminali metodo di anatre che erano i valori Ct <30 (che indica una alta concentrazione di RNA virale). Gli altri quattro campioni sono risultati positivi con il protocollo tradizionale aveva valori Ct> 30 (meno concentrato) e non potrebbe essere rilevato dal nostro protocollo.
Campioni solo con titoli di virus relativamente alta sono risultati positivi nel nostro test ed è probabile che la sensibilità del metodo è stata la fonte di mancato riconoscimento di tutti i campioni positivi. Inoltre, la dimensione del campione in questo studio era molto bassa e il metodo può essere completamente sviluppato e valutato se gli esperimenti più controllata e rigorosa vengono effettuate. Tuttavia, se questi campioni sarebbero stati raccolti da una zona remota, l'analisi tradizionali non sarebbe stato possibile a tutti. Inoltre, questi primi risultati derivano da esperimenti pilota che hanno bisogno di un'ulteriore ottimizzazione. Un periodo di due anni in un deposito regolare congelatore -20 ° C dopo la raccolta del campione, probabilmente influenzato anche la qualità del RNA virale. Questa degradazione dell'RNA possibile è una questione importante quando si tratta di stoccaggio a temperatura ambiente di virus inattivati. Campioni conservati nei liquidi alternativa come detto sopra soffrono di un notevole degrado che incide di più si estende l'analisi del genoma virale 16. Anche se non testati nel nostro studio, le carte FTA hanno dimostrato di essere adatto a preservare intatto molecole di RNA in altri sistemi di RNA che sono molto simili ai virus dell'influenza aviaria, 25, 26.
Disclosures
Cattura, manipolazione e degustazione di uccelli sono stati fatti a seguito della legislazione nazionale e sono stati approvati dal Consiglio svedese per l'Agricoltura e l'animale comitato di ricerca etica.
Acknowledgments
Ringraziamo Dibbits Bert per assistenza tecnica. L'allevamento degli animali e il Gruppo Genomica, Università di Wageningen, Paesi Bassi, generosamente ci ha ospitato nel loro laboratorio. Il personale del Uccello Ottenby Observatory, in Svezia, si ringrazia per la cattura e il campionamento dei germani reali, in particolare Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Ringraziamo Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres per riprese a Ottenby, e Mano Camon per le riprese in laboratorio. Daniel Bengtson fornito fotografie anatra bello per la parte video di questa pubblicazione. Ulteriore materiale libero da la Biblioteca immagine CDC pubblica (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) è stato utilizzato: il microscopio elettronico (n. 280; dal Dott. Erskine Palmer) e illustrazione (n. 11823; da Douglas Giordania) del virus dell'influenza. Il sostegno finanziario è stato dato dal KNJV (Royal Paesi Bassi Hunters Association), il Ministero olandese dell'Agricoltura, della Faunafonds e la Stichting de Trusts Eik (sia in Olanda), il Consiglio svedese della ricerca (Grant no. 2007-20774) e la CE -fondato Newflubird progetto. Prodotti chimici isolamento di RNA sono stati un dono generoso di Ambion, Inc, l'azienda RNA. Questo è il contributo n. 245 dal Bird Ottenby Osservatorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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