Summary
조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.
Abstract
조류 독감 바이러스 (AIVs)는 인간이 하나 등 많은 포유 동물을 감염. 이러한 AIVs 거의 모든 가능한 바이러스 subtypes 2 품고 그들의 자연적인 호스트로 다양합니다. 독감의 인간 전염병은 원래 AIVs 3 줄기. 최근에 H5N1 발생하는 동안 많은 치명적인 인간의 환자가보고되었다. 최근, 새로운 AIV 관련 변종은 '신종 인플루엔자의 유행'4 유발, 인간의 인구를 휩쓸고. 인간의 무역과 운송 활동이 높은 병원성 종자 5의 확산에 대한 책임 것으로 보인다 있지만, 분산도 일부 야생 조류 6, 7에 의한 수 있습니다. 그러나 모든 AIV 종자의 실제 저수지 야생 조류입니다.
이것과 가금류 산업에 심각한 상업적인 손실의 얼굴에 대한 반응으로, 대형 감시 프로그램은 AIVs의 생태에 대한 정보를 수집하고, 특정 고도의 병원성 변종 8-12을 감지하는 조기 경보 시스템을 설치하는 세계적으로 구현되었습니다. 전통 virological 방법은 바이러스가 온전하고 분석하기 전에 재배가 필요합니다. 이것은 깊은 냉동고 및 수송 동안에있을 무거운 biosafety 절차와 엄격한 감기에 사슬을 요구. 장기 감시 따라서 일반적으로 잘 갖추어진 실험실에 가까운 몇 가지 필드 방송국에 제한됩니다. logistically 성가신 절차를 구현하지 않는 원격 영역은 샘플 수 없습니다. 이러한 문제는 13 인정, 14, 대체 저장소 및 운송 전략의 사용 (알콜이나 구아니딘) 15-17를 조사하고 있습니다. 최근 크라우스 외. 18 특수 여과지에 따라 수집하는 방법, 저장 및 전송 AIV 샘플을 소개했다. FTA 카드 19 건조 저장 기준 20 RNA를 보존 및 연락처 21시 비활성 병원균을 렌더링합니다. 이 연구는 FTA 카드 리버스 전사 PCR과 결과 cDNA가 합성 및 바이러스 유전자와 결정 될 수 AIV RNA를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다.
AIV가 사용되었고, 샘플 개별적으로 처리했는지 크라우스 외. 18 연구에서는 실험실 격리. 여기에 제시 확장에 Ottenby 버드 천문대 (SE 스웨덴)에서 오리 트랩에서 야생 조류에서 faecal 샘플은 현장 조건에 따라 방법의 유용성을 설명하기 위해 직접 테스트했다. cloacal 면봉으로 오리 및 샘플 수집 잡는 것은 증명합니다. 현재 프로토콜은 하나의 튜브 처리에서 96 잘 설계 작업 흐름의 최대 - 스케일링을 포함합니다. 전통적인 방법보다 민감하지만, FTA 카드의 방법은 대형 감시 제도에 대한 훌륭한 보완을 제공합니다. 그것은 알코올이나 구아니딘 같은 위험한 시약의 운송과 관련하여 시원한 체인 또는 안전 규정을 유지하기 위해 필요없이 어디서나 세계에서 샘플의 수집과 분석이 가능합니다.
Protocol
1. 오리 트래핑 및 Cloacal 보라고
- 함정 류어 오리 또는 음식을 유치하여 케이지에 속 Anas (또는 다른 조류)의 오리 dabbling, 개인 카드 보드 상자에 넣어 두었어요. 상자에 교통 시간은 함정에 가까운 거리 내에서 필드 스테이션을 설치하여, 예를 들어, 최소로 보관해야합니다. 물류 환경은 각 연구에 따라 다를 수 있습니다. 조언 및 관련 동물 윤리위원회의 승인이 설정 각각의 새로운 추적을해야합니다. 또는 또한 사냥꾼 쇼트 조류는 샘플 수 있습니다.
- 그 몸에 꽉 날개를 개최하여 상자의 오리 뽑아 낸다. 직접 상자의 아래쪽에서 가지 경우 대부분 존재하는 신선한 떨어지는를 샘플. 멸균 면봉으로 그들을 들고 왓먼 FTA 카드에 유체를 적용해야합니다. 그렇지 않다면, cloacal 보라고을 수행합니다.
- 의 뒷면에있는 오리를 켭니다. 이것은 하수에 대한 액세스를 허용하고 샘플링을 용이하게합니다. 하수구가 꼬리의 기본에 가까운 복부 아래에 위치하고 튀어나온 구조입니다. 경험이 풍부한 사람이 보유하고 샘플 새를 동시에, 또는 다른 두 사람이 도와 드릴 수 없습니다.
- 조심스럽게 멸균 플라스틱 레이온 면봉 (코판, 이탈리아) 약 1cm를 삽입하고 하수의 완만한 소용돌이를 확인하십시오. 왓먼 FTA 카드의 표면을 통해 하수의 유체로 면봉을 롤. 동물의 샘플링을 수행한 후에는 즉시 릴리스는 바람직합니다.
- 최소한 1 시간 동안 실온에서 FTA 카드를 건조 후, 종이 봉지 (예 : 봉투)에 각각 샘플을 저장합니다. 스토리지 아마도 습한 기후에서 실리카 비즈와 상온에서 가능합니다. 전송 및 기관 'biosafety 임원을 받고는 병원균이 FTA 카드 표면과 접촉시 운영 중지 상태가 될 있기 때문에, 일반 우편으로 FTA 카드를 보낼 수 있도록 수 있습니다.
2. 바이러스성 RNA 격리
- 찌끼 / cloacal 유체를 포함하여 FTA 카드 자료를 추출합니다. 펀치 세 번 해리스 2mm의 구멍을 뚫는 장소 RNase 무료 96well 판의 우물에 사람을 모두와 함께 디스크. 각각의 새 샘플 사이, 알코올과 김 정학 (Kimtech) 닦아와 함께 조심스럽게 구멍을 뚫는를 청소하십시오. 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 긍정적인 컨트롤은 갓 FTA 카드에 적용 실험실 변형, 또는 긍정적인 결과를 얻을 수 알지있는 자연 샘플로 구성될 수 있습니다. 대조군으로, 빈 FTA 카드에서 디스크를 펀치. 또한, (템플릿으로 물로) 나중에 실험에서 PCR 컨트롤에 대한 또 다른 잘 무료로 둡니다.
- 70μl RNA 빠른 추출 솔루션 (앰비온)과 열 밀봉 플레이트 (AbGene 온습 실러) 추가합니다. (; 사전에 시험이 사용된 접시 쉐이크 모델에 따라 다름) 유출 - 이상 발생하지 않는 결정 속도 상온에서 접시 쉐이크 5 분 알을 품다.
- MagMAX - 96 바이러스 RNA 격리 키트 (앰비온)와 제조 업체의 프로토콜에 따라 바이러스성 RNA 격리 운반. 간단히 : 시간을 추가하십시오 130μl 준비 용해 / 각 잘하는 바인딩 솔루션 (키트에서). 전송 50μl는 각 잘하는 FTA 카드 자료를 추출. 1 분 접시를 흔들어.
- 그리고 아래로 pipetting하여 각 샘플과 섞어 20μl 준비 구슬 믹스 (키트에서) 추가합니다. 5 분 결정 속도를 흔들어. RNA 분자는 자석 구슬에 바인딩합니다.
- 자장으로 접시를 이동 96 잘 구슬을 캡처하라. 사용 자성 스탠드의 모델에 따라,이 5 분 이상 걸릴 수 있습니다. 솔루션은 완전히 명확 살이되면 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 세척 용액 1 두 번 씻어 솔루션 2 (키트에서)와 함께 두 번 구슬을 씻으십시오. 4 세척 단계 각 각 샘플을 150μl 준비 세척 솔루션을 추가하는 경우, (또는 솔루션은 완전히 명확까지) 결정 속도에 1 분, 자기 서서 접시를 이동 약 5 분 동안 구슬을 캡처 흔들, 제거하고 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 접시를 제거 다음 씻어 솔루션을 추가하고, 같은 이전에 세척 단계를 수행합니다. 마지막 세척 단계 후, 2 분 동안 접시 통에 실온에서 가능하고 공기 건조 비즈만큼 씻어 솔루션을 제거합니다.
- 비즈에서 RNA를 해제하고 접시 쉐이크 4 분 흔들 용출 버퍼의 50μl를 (키트에서) 추가합니다. 이전에 설명한대로 구슬을 캡처합니다. 뜨는 지금 하류 애플 리케이션을위한 준비가 분리된 RNA가 포함되어 있습니다.
3. AIV 매트릭스 진의 RT - PCR
25 μl 반응에서 한 단계 RT - PCR 교통 시스템과 역방향 전사 PCR (RT - PCR) (Promega)를 수행 (. 크라우스 외에서 조정 18 Fouchier 외 22.)
| Nuclease 무료로 물 | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 버퍼 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| 프라이머 M52C 22 (10 μm의) | 2.5μl |
| 프라이머 M253R 22 (10 μm의) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 ㎜) | 7μl |
| AMV 반대 transcriptase (5u/μl) | 0.5μl |
| Tfl 효소 (5u/μl) | 0.5μl |
| RNA 샘플 | 5μl |
Biometra T1 thermocycler의 PCR 조건은 45 45 분 초기 역방향 전사 ° C, 94에서 이분 초기 변성 다음 ° C와 40 사이클 : 94 ° C 1 분, 1 분 56 ° C, 그리고에 대한 2 분 동안 68 ° C. 68에서 추가로 7 분 연신율은 ° C의 증폭을 마칩니다.
4. AI - 긍정적인 샘플에 대한 검사 및 젤에서 타겟 파편의 정화
- 사전 심사 1 %의 ethidium의 브로마이드 (100 ML 젤 당 2.5μl) 물들일 1 % 아가로 오스 겔 (로체)에 2μl 배 로딩 염료 (BioRad)와 6μl 물과 혼합 PCR 제품의 2μl를로드합니다.
- DNA 크기 표준 (BioRad EZ 하중 100 BP의 사다리)와 함께, 120V에서 1 시간 동안 젤을 실행, 겔 문서 시스템과 시각화. 그림 1의 예제를 참조하십시오.
- 예상 크기 범위에서 증폭된 파편 (200 BP 300 BP (대상 조각은 244 BP)을 사이로 샘플을 선택합니다. 2 6μl 배 로딩 염색과이 후보의 전체 PCR 반응 볼륨을 (23μl를 ~ 중 왼쪽에 있습니다)로드 %의 ethidium의 브로마이드는 아가로 오스 겔을 스테인드 2 시간 동안 실행됩니다.
- UV - transilluminator (Bioblock 과학)에 젤 장소와 시각 검사. 그림 2에서 예제를 참조하십시오. 개별 1.5 ML 반응 튜브에 메스와 배치로 젤에서 올바른 크기의 엑사이스 밴드. Zymoclean 젤 DNA 복구 키트 (Zymo 연구)와 예를 들어, 겔에서 조각을 정화.
5. 시퀀싱 및 PCR 제품 식별
- ABI 빅 다이 3.1 화학 (응용 Biosystems)와 ABI 3730 모세관 시퀀서에 대한 인스턴스에 대한 대상 조각 생거 시퀀싱을 수행합니다. 포함된 10μl 권 시퀀싱 반응을 준비 10-20 NG 젤 - 정화 템플릿 cDNA, 1.75μl 배 희석 버퍼, 0.5μl 빅 다이 V3.1의 premix, 1 μl 앞으로 프라이머 (M52C 20, 10 ㎜)과 ddH2O 있습니다. 자전거 조건은 다음과 같습니다의 25주기에 의해 다음 1 분 초기 변성, : 96 10 S ° C, 45 ° C 60 4 분 5 S ° C. 정화 및 내부 프로토콜에 따라 순서 반응을 준비합니다.
- 이러한 바이오 정보 (NCBI에 대한 국립 센터 BLAST와 같은 웹 기반 도구를 예를 들면 같은 GenBank23 같은 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대한 cDNA 시퀀스를 발생 식별 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. 대표 결과 :
맬러즈 (Anas platyrhynchos)는 2007 년 12 월에 Ottenby 버드 천문대에서 샘플링했다. 이 프로토콜에서 설명한대로 각 맬러드에서 FTA 카드의 샘플을 촬영했다. 배송 후, FTA 카드는 2 년간 -20 ° C에서 냉동실에 보관했다. 연구소의 동일한 FTA 카드 샘플 크라우스 외에 테스트 분리. 18은 긍정적인 제어뿐만 아니라 아홉 열배 시리얼 dilutions로 포함되었습니다. 마이너스 2 점 컨트롤) 빈 FTA 카드에서 추출, 구멍을 뚫는에서 - 이월있다면 테스트하고, nuclease 무료 물을 템플릿으로 사용어진 II) RT - PCR 반응, 오염 동안 발생한 경우 테스트, 아니면되었습니다 PCR 반응의 준비 인치
84 샘플을 분석했다. 다음 84 샘플의 PCR 제품의 겔 그림은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 자연 샘플 unspecific 밴드의 수많은이 선고를받은 여러 미생물 contaminations의 존재로 인해 볼 수 있습니다. 그러나, 뇌관의 쌍 대상 조각은 244 BP 깁니다. 약 올바른 크기 범위 (200 BP 300 BP 사이)에서 조각을 제작 샘플의 하위 집합의 전체 PCR 반응 볼륨 젤 (그림 1)에로드되었습니다. 겔에서 해고당한 밴드 중 일러스트는 보충 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤 이외에,이 샘플의 두 종류 (69899 및 69912) 새로운 프로토콜에 의해 긍정했다. 다른 모든 밴드가 가장 밀접하게 박테리아 시퀀스를 닮은, 혹은 전혀 읽을 수있는 순서를 양보 안하면서 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 BLAST 검색, AI 유전자 매트릭스 (그림 3)로 자신의 정체성을 공개했다.
그림 1. PCR 제품의 예비 심사의 젤 그림. 긍정적인 제어 2 μl PCR 제품, S긍정적인 컨트롤, 두 부정적인 컨트롤과 84 cloacal 샘플 에리얼 dilutions가로드되었습니다. 48 샘플은 아래쪽 패널에서 최고의 겔 패널, 48 샘플에 표시됩니다. 빨간색 화살표는 100 BP의 DNA 크기의 표준에 사용되는 겔 차선을 나타냅니다. 그림 들면, 빨간 동그라미가 예상 크기 범위에서 밴드를 보여줍니다. 블루 동그라미 unspecific amplicon (상단 왼쪽) 또는 크기 100 BP (하단 오른쪽) 아래 프라이머의 이합체의 인위를 나타냅니다.
그림 2. 200 BP 300 BP (대상 244 조각 BP) 사이의 밴드와 함께 올바른 크기의 범위에서 파편 샘플 선택. 샘플이 선택되었습니다. 녹색 화살표가 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 두 빨간색 화살표는 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 자신의 cDNA 시퀀스를 비교하여 AIV 긍정적인 것으로 확인되었다 샘플을 나타냅니다.
그림 3. NCBI에서 대표 BLAST 검색의 화면 캡처. excised 조각에서 얻은 cDNA 시퀀스 중 하나는 NCBI 웹사이트에서 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 질의했다. 예제가 올바르게 AI 매트릭스 유전자 조각으로 식별됩니다. 이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1. 겔에서 excised 선택된 샘플의 밴드.이 사진은 200 BP 300 BP 사이의 후보 밴드 후에 그림 1에 묘사된 겔에서 찍은이 도려되었습니다.
Discussion
여기에서 설명한 프로토콜은 AIV의 존재를 faecal 또는 유사한 샘플을 화면으로 보충 방법을 제공합니다. 이것은 특히 샘플 수집 빠르고 쉽게하도록 설계되었습니다. 이렇게하면 같은 사냥꾼이나 야생 동물의 관리자로서 적은 훈련 명, AI 감시에 기여 할 수 있습니다. 가능한 샘플을 냉동 것은 권장하지만 아무도 시원한 체인은 적용할 필요가 없습니다. 실온의 며칠 예를 들어 실험실로 이송하는 동안, 카드 건조 남아만큼, FTA 카드에서 RNA 분자에 대한 문제가되지 않았습니다. 이러한 알코올 15 구아니딘 16로 현재 연구 공동체에 의해 평가하는 다른 비 냉각 저장 시스템은, 때문에 그들의 유해 자연의 특별 운송 계약이 필요합니다. 반면, FTA 카드 방식은 유해 물질의 전달을 요구하지 않습니다. 그러나, 이러한 측면에서 또 다른 흥미로운 저장 매체는 17도 위험이 아니라고 RNAlater ™입니다. 샘플 분석은 어떤 표준 분자 연구실에서 진행하실 수 있습니다. 일반적인 PCR 반응 및 모세관 배열 이외의 특별한 장비는 필요 없었습니다. 이미 샘플 컬렉션에있는 잠재적인 병원성 대리인이 FTA 카드의 항균 및 항바이러스 활동에 의해 inactivated 있었기 때문에 모든 단계 biosafety 수준없이 진행 될 수 있습니다.
교차 오염 및 그 이후의 거짓 긍정적인 표본은 야생 조류 샘플의 실험에서 관찰되지 않았습니다. 그러나, RNA 및 PCR 작업했을 때 사전 및 사후 PCR 단계 작업 장소와 별도의 객실을 청소 특별한주의를 지불하는 것이 좋습니다. 펌 후드에 근무하는 실험실에서 에어로졸 오염의 위험을 감소시킵니다. Pipetting 필터 팁을 진행해야합니다.
우리가 84 샘플의 여섯 전통 RealTime에 의해 RT - PCR 방법 24 RealTime을 RT - PCR에서 CT 값이 알려져있다 긍정적인 것을 알고있는 동일한 오리에서 동시에 촬영한 샘플에 대한 이전의 연구에서. CT 값 <30 (바이러스 RNA의 높은 농도를 나타내는)했다 오리에서 우리의 방법의 줄기에 의해 감지 두 가지 긍정적인 샘플. 전통적인 프로토콜로 긍정적인하던 나머지 네 가지 예제> 30 일 (이하 집중)와 우리의 프로토콜에 의해 감지되지 않았습니다 CT 값을했다.
상대적으로 높은 바이러스 titers만이 샘플의 분석에 긍정적인되었으며 그것은 방법의 감도는 모든 긍정적인 샘플을 감지하는 실패의 원인이라고 가능성이 높습니다. 또한, 현재 연구의 표본 크기가 매우 낮은 경우 더 많은 통제와 엄격한 실험을 수행하는 경우 메서드는 완전히 개발 및 평가 수 있습니다. 이 샘플은 원격 지역에서 수집했을 경우에는, 전통적인 분석이 전혀 불가능되지 않았을 것입니다. 또한 이러한 첫번째 결과 더 최적화가 필요 파일럿 실험에서 줄기. 샘플 수집 후 정기적으로 -20 ° C의 냉장고에서 2 년간의 저장 기간은 아마도 또한 바이러스 RNA의 품질에 영향을. inactivated 바이러스의 상온 저장을 상대할 때는이 가능한 RNA 저하가 중요한 문제입니다. 상기와 같은 다른 액체에 저장된 샘플은 바이러스 게놈 16 이상 펼쳐진 분석 영향을 크게 저하의 고통. 우리의 연구에 테스트하지 않지만, FTA 카드는 물론 조류 독감 바이러스 25, 26 매우 유사한 다른 RNA 시스템에 그대로 RNA 분자를 보존하기 위해 적합한 것으로 입증했습니다.
Disclosures
, 트래핑 취급 및 조류 샘플링하는 것은 국가의 법률에 따라 수행되었으며 농업과 연구 동물 윤리위원회의 스웨덴어위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원 버트 Dibbits 감사합니다. 동물 사육 및 게놈 그룹, Wageningen 대학, 네덜란드, 아낌없이 자신의 실험실에서 우리를 열었다. Ottenby 버드 천문대, 스웨덴의 직원은 특정 매그너스 Hellström, 마커스 Danielsson, 크리스토퍼 매그너슨 및 Stina 앤더슨에 맬러즈 트래핑 및 샘플링에 대한 감사입니다. 우리는 실험실에서 촬영을위한 Sanne 스벤슨, Jonatan Qvist 및 Ottenby에서 촬영을 위해 당 엑셀 Gjöres, 그리고 마노 Camon 감사드립니다. 다니엘 Bengtson이 간행물의 비디오 부분에 대한 아름다운 오리 사진을 제공했습니다. CDC 보건 이미지 라이브러리 (필,에서 자유 자재 http://phil.cdc.gov/phil/는 ) 사용 되었음 : 전자 현미경 (제 280; 박사 어스킨 팔머에 의해)와 그림 (제 11823을; 인플루엔자 바이러스의 더글러스 요르단)에 의해. 재정 지원은 KNJV (로얄 네덜란드 사냥꾼 협회), 농업의 네덜란드 교육부, Faunafonds과에는 Stichting 드 Eik 트러스트 (모두 네덜란드)에 의해 주어진 것으로 스웨덴 연구 협의회 (부여 안돼. 2007-20774)과 EC Newflubird 프로젝트 설립. RNA 격리 화학 물질 앰비온, Inc의 RNA 회사의 후한 선물했다. 이것은 Ottenby 버드 천문대에서 기여 번호 245입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
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