Summary
Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido en
Abstract
La incipiente levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un modelo de sistema de gran alcance para la definición de los mecanismos fundamentales de muchos procesos celulares importantes, incluidos los que tienen relación directa con la enfermedad humana. Debido a su corto tiempo de generación y bien caracterizado del genoma, una gran ventaja experimental del sistema de modelo de la levadura es la capacidad de realizar exámenes genéticos para identificar los genes y las vías que están involucrados en un proceso determinado. En los últimos treinta años, tales exámenes genéticos se han utilizado para dilucidar el ciclo celular, la vía secretora, y muchos aspectos más altamente conservadas de la biología de las células eucariotas 1-5. En los últimos años, varias bibliotecas genoma de cepas de levadura y plásmidos se han generado 6.10. Estas colecciones permiten ahora a la interrogación sistemática de la función genética utilizando la ganancia y la pérdida de la función de los enfoques 11-16. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado para el uso de un protocolo de levadura de alto rendimiento de transformación con un robot de manejo de líquidos para llevar a cabo una pantalla sobreexpresión plásmido, vestida con una biblioteca de 5.500 plásmidos de levadura. Hemos estado utilizando estas pantallas para identificar modificadores genéticos de toxicidad asociados con la acumulación de la agregación de las proteínas humanas expuestas a la enfermedad neurodegenerativa. Los métodos que aquí se adaptan fácilmente al estudio de otros fenotipos celulares de interés.
Protocol
1. Los preparativos para la transformación de la levadura
Este protocolo está diseñado para diez placas de 96 pozos, pero se puede escalar hacia arriba o hacia abajo según corresponda. Hemos encontrado que este protocolo no funciona bien desde hace más de veinte placas de 96 pozos por cada ronda de la transformación. El procedimiento de transformación completa (desde el paso I.3) tendrá una duración aproximada de ocho horas.
- Alícuota de 5 10μL de ADN plásmido (100 ng / l) de la biblioteca de la levadura FLEXGene ORF en cada pocillo de un fondo redondo de 96 pocillos con el manejador de RapidPlate Biorobot líquido. Lugar descubierto placas de 96 pozos en la campana de humos durante la noche banco limpio para secar. Hemos encontrado eficacia similar de transformación con el CEN y plásmidos 2μ levadura.
- Inocular 200 ml de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación (10 g / L de extracto de levadura, peptona 20 g / L, 20 g / l de glucosa) con la cepa de la consulta en un matraz Erlenmeyer de 500 ml desconcertado. Incubar toda la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar para estos cultivos iniciadores.
- A la mañana siguiente, se diluye el esfuerzo de consulta a OD 600 = 0,1 en 2 litros de YPD. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) hasta que el cultivo llegue a OD 600 = 0,8 hasta 1,0. Para un óptimo crecimiento, crecen dos culturas separadas 1L en un recipiente de 2,8 L desconcertado. Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar en lugar de YPD.
2. La levadura de transformación
- Las células por centrifugación de la cosecha. Llenar cuatro tubos cónicos desechables 225ml con levadura de cerveza y giran a 3.000 rpm (~ 1800 xg) durante 5 minutos en centrífuga de mesa (Eppendorf 5810R). Elimínese el líquido sobrenadante y repetir hasta que todas las células se cosechan.
- Lavar las células en 200 ml de autoclave destilada H 2 O. Resuspender el sedimento celular por agitación o agitación. Combine las células en un tubo cónico de 225 ml. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
- Preparar la solución 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 en agua destilada en autoclave). Lavar las células en 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Agitar y / o vórtice de asegurar pellet es completamente resuspendido.
- Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm).
- Añadir β-mercaptoetanol 0,1 M a. Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm). Nota: Este paso puede omitirse si la utilización de cepas de levadura que son sensibles a los β-mercaptoetanol. Hemos encontrado que este paso no es esencial para la transformación exitosa, sin embargo, no mejora la eficiencia de transformación.
- Hervir 2 ml de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml) durante 15 minutos, y luego se enfría en hielo.
- Añadir 2 ml de ADN de esperma de salmón cocido a la mezcla de la célula. Precaución: puede formarse un precipitado con la adición de ADN de esperma de salmón a la mezcla de células. El uso de un Pipetman y 200 l punta, retire con cuidado cualquier precipitado que se forma debido a que esto puede interferir con la pipeta abajo.
- 50μL alícuota de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con el Rapidplate BioRobot (también puede utilizar una pipeta multicanal). No se mezclan.
- Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.
- Preparar 200 ml de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% de PEG-3350, DMSO 20 ml, 20 ml LiOAc 1M). Preparar la solución inmediatamente antes de su uso.
- Añadir 125μL de PEG / LioAc / DMSO a cada pocillo. Mezclar por aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con RapidPlate.
- Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.
- Choque térmico de las células a 42 ° C durante 15 minutos en un incubador seco. No apile los platos. Nota: Hemos encontrado que este paso de choque térmico no es esencial para la transformación exitosa. Para ciertas cepas de levaduras (por ejemplo, los mutantes sensibles a la temperatura), golpe de calor es perjudicial. Previamente hemos reducido el tiempo de golpe de calor a un minuto y han sido capaces de transformar con éxito una cepa de levadura albergar una mutación temperatura ypt1 sensibles que utilizan este protocolo.
- Giro placas a 2500rpm (~ 1100 xg) durante 5 minutos, el uso de adaptadores de centrífuga para dar cabida a placas de 96 pozos. Eliminar la solución de PEG por las placas de inversión de más de cubo de residuos. Blot placa invertida sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual (las células que permanecen en el fondo de los pozos).
- Enjuague las células mediante la adición de 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate.
- Giro placas a 2500rpm durante 5 minutos y retirar el sobrenadante por el cubo de residuos invertir más y en toallas de papel secante.
- Añadir 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate.
- Se incuba a 30 ° C durante 2 días sin agitación. Después de 2 días, pequeñas colonias de células se empiezan a formar en la parte inferior de cada transformado con éxito así.
3. Manchado ensayo
- Dispensar 200μL de rafinosa medios basados en mínimos (por ejemplo, sraf /-Ura) en cada pocillo deun nuevo fondo plano placa de 96 pocillos.
- Mezcle cada pocillo de la placa de transformación mediante la aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con Rapidplate.
- Inocular las placas con sraf 5μL de mezcla de células de la placa de la transformación.
- Se incuba a 30 ° C durante un día. Pequeñas colonias deben estar presentes en la parte inferior de cada bien después de un día.
- Colonias lugar en tarjetas SD /-Ura y SGal / Ura-placas en campana. Esterilizar de 96 perno replicador (Frogger) por fuego. Mezcla de colonias con Frogger antes de manchas en las placas de medios selectivos. Después de ver, permite secar las placas en campana durante 5-10 minutos.
- Se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.
Placas de fotografía con cámara digital, y comparar visualmente el crecimiento de colonias en SGal / Ura-placas para encontrar colonias en las que la toxicidad se incrementa la tensión de consulta (un crecimiento más lento / colonias menos densas) o suprimida (un crecimiento más rápido / más densas colonias).
4. Los resultados representativos:
Figura 1. Levadura pantalla sobreexpresión plásmido para identificar supresores y potenciadores de la toxicidad TDP-43. TDP-43 es una proteína humana que ha sido implicada en la patogenia de la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig). Agregados citoplasmáticos de TDP-43 acumulan en el cerebro y las neuronas de médula espinal de pacientes con ELA 17. Expresando TDP-43 en células de levadura resultados de la agregación y la citotoxicidad de 18 años. Hemos utilizado este modelo de sistema para definir los mecanismos de toxicidad de la TDP-43 19,20. Se muestran ejemplos representativo de platos de nuestra levadura TDP-43 pantalla modificador de toxicidad. Estas placas colonias con una pantalla integrada de galactosa-inducible TDP-43 plásmido y se transforman también con plásmidos de la biblioteca de expresión FLEXGene ORF. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de TDP-43 o los plásmidos FLEXGene. La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP-43 y el ORF en los plásmidos FLEXGene. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de la TDP-43. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de la TDP-43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí se presenta un protocolo para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento de la sobreexpresión plásmido en la levadura. Este método permite la detección rápida e imparcial de modificadores genéticos de muchos fenotipos celulares distintos. Con este enfoque, un investigador puede filtrar una parte importante del genoma de la levadura en cuestión de semanas. Este enfoque no sesgado también permite la identificación de los modificadores, que pueden no haber sido predicho sobre la base de los resultados anteriores. Hemos utilizado este enfoque para identificar los modificadores de la toxicidad asociada a la agregación de las proteínas humanas enfermedad neurodegenerativa 19,21-23. Sin embargo, debido a la adaptabilidad de este protocolo de estudio de otros procesos celulares, este protocolo será de utilidad para los investigadores que abarcan una amplia gama de importantes cuestiones biológicas. Por ejemplo, hemos encontrado este método de detección útil para la identificación de genes y vías implicadas en la adaptación al estrés ambiental, como metales pesados y el estrés oxidativo. Aquí nos hemos centrado en una biblioteca de plásmidos, la biblioteca de la levadura FLEXGene 9. Sin embargo, hay varias bibliotecas de otras levaduras plásmidos disponibles, que también podrían ser utilizados para estos 6,8 pantallas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca del Centro de Investigación Packard para la ELA en la Universidad Johns Hopkins (ADG), Premio a la Innovación Nuevo un director de los NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), el Premio de la Fundación Rita Allen Académico. ADG es una beca Pew en las ciencias biomédicas, con el apoyo de The Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
