Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm
Summary
Här beskriver vi en plasmid överuttryck skärm<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Med hjälp av en klädd plasmid bibliotek och en hög genomströmning jäst omvandling protokoll med ett vätskehantering robot.
Abstract
Den spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae, är en kraftfull modell för att definiera grundläggande mekanismer i många viktiga cellulära processer, inklusive de med direkt relevans för mänskliga sjukdomar. På grund av dess korta generationstid och väldefinierad genomet, är en stor experimentell fördel med jäst modellsystem förmågan att utföra genetiska skärmar för att identifiera gener och signalvägar som är involverade i en viss process. Under de senaste trettio åren sådana genetiska skärmar har använts för att belysa cellcykeln, Utsöndringsvägarna, och många fler starkt konservativa delar av eukaryota cellbiologiska 1-5. Under de senaste åren har flera genomewide bibliotek av jäststammar och plasmider genererats 6-10. Dessa samlingar kan nu för systematisk förhör av geners funktion med hjälp av vinst-och förlust-av-funktionen metoder 11-16. Här ger vi ett detaljerat protokoll för användning av en hög genomströmning jäst omvandling protokoll med ett vätskehantering robot att utföra en plasmid överuttryck skärmen med en klädd bibliotek med 5500 jäst plasmider. Vi har använt dessa skärmar att identifiera genetiska modifierare av toxicitet i samband med ackumulering av aggregering som ofta drabbas människor neurodegenerativa sjukdomar proteiner. Metoderna som presenteras här är lätt att anpassa till studiet av andra cellulära fenotyper av intresse.
Protocol
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en hög genomströmning plasmid överuttryck skärm i jäst. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb och objektiva screening för genetiska modifierare av många olika cellulära fenotyper. Med denna metod kan en forskare visa en betydande del av jästgenomet inom några veckor. Detta objektiva tillvägagångssätt gör det möjligt även för identifiering av modifierare, vilket inte kan ha förutsett på grundval av tidigare fynd. Vi har använt denna metod för …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Packard Centrum för ALS-forskning vid Johns Hopkins (ADG), en NIH direktörens Nya Innovator Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), den Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG är en Pew Scholar i Biomedicinsk vetenskap, som stöds av The Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
